Get a site

پایان نامه ارشد:تولید آنزیم پروتئاز در بیوراکتور سینی‌دار با بهره گرفتن از فرآیند تخمیر حالت جامد

پایان نامه رشته مهندسی شیمی

گرایش :بیوتکنولوژی

دانشکده‌ی مهندسی شیمی

پایان‌نامه برای دریافت درجه‌ی کارشناسی ارشد

در رشته‌ مهندسی شیمی گرایش بیوتکنولوژی

عنوان:

تولید آنزیم پروتئاز در بیوراکتور سینی‌دار با بهره گرفتن از فرآیند تخمیر حالت جامد

استاد راهنما:

پروفسور قاسم نجف پور

استاد مشاور:

پروفسور محسن جهانشاهی

بهمن ماه ۱۳۹۳

چکیده
پروتئازهای میکروبی در بین مهم‌ترین آنزیم‌های هیدرولیز‌کننده قرار‌دارند که حدود %۶۰ از بازار جهانی آنزیم‌های صنعتی را به خود اختصاص داده‌اند. در این پژوهش، ستنز آنزیم پروتئاز در فرآیند تخمیر حالت جامد با بهره گرفتن از باکتری Bacillus. licheniformis مورد بررسی قرار‌گرفت. ضایعات و محصولات مختلف کشاورزی شامل سبوس گندم، سبوس برنج، باگاس، پوسته ذرت، آرد‌ذرت و آرد‌جو بعنوان سوبسترا مورد استفاده قرار‌گرفتند. پروتئاز تولیدی از پوسته گندم نسبت به بقیه سوبسترا فعالیت بیشتری نشان داده است. اثر پارامترهای مختلف استخراج شامل نوع و مقدار محلول استخراج کننده و زمان اقامت در شیکر مورد ارزیابی قرار‌گرفت. بیشترین میزان بازیابی پروتئاز با بهره گرفتن از ۵۰ میلی‌لیتر بافر تریس پس از طی مدت ۱ ساعت در شیکر بدست آمد. علاوه بر این، تأثیر پارامترهای عملیاتی چون زمان، دما، pH، رطوبت ابتدایی، رطوبت کابین، اندازه ذرات و میزان مایه تلقیح بر تولید آنزیم مورد بررسی قرار‌گرفت. نتایج نشان داد که بیشترین میزان فعالیت آنزیم پروتئاز پس از ۴۸ ساعت تخمیر، در دمای Cº ۳۵ ، pH ابتدایی برابر ۹، رطوبت کابین %۹۰، اندازه ذرات در محدوده cm 2-1 و رطوبت اولیه %۲۰۰ برای سینی بالایی و %۱۵۰ برای سینی میانی بدست آمد. همچنین تأثیر مکمل‌های مختلف کربنی و نیتروژنی بر تولید پروتئاز بررسی‌شد. نتایج نشان‌داد که با غنی‌سازی سوبسترا با سبوس برنج (w/w %1) و آرد ذرت ( w/w%2)، بیشترین فعالیت آنزیم پروتئاز بدست‌آمد. حداکثر فعالیت پروتئاز پس از گذشت ۴۸ ساعت، تحت تمامی شرایط مطلوب، میزان فعالیت U/gds 1/1281 و U/gds 7/1048 به ترتیب برای سینی بالایی و میانی بدست آمد. تأثیر دما و pH بر فعالیت و پایداری آنزیم مورد بررسی قرار‌گرفت. نتایج نشان داد که پروتئاز تولیدی ماهیت قلیایی داشته و پایداری بسیار قابل توجهی در محدوده تغییرات دما در بازه Cº ۸۵-۳۰ و مقادیر pH بین ۱۳-۷ داشته است و بیشترین فعالیت در مقدار pH برابر ۸ و دمای Cº۶۵ حاصل شده است. همچنین کاربرد آنزیم تولیدی در پردازش چرم و هیدرولیز لایه ژلاتین از فیلم‌های عکاسی و همچنین به عنوان افزودنی به شوینده، مورد بررسی قرار‌گرفت. نتایج نشان داد که پروتئاز قلیایی حاصل از B. licheniformis قابلیت بسیار خوبی در حذف لکه‌های مختلف از پارچه، موزدایی از پوست گاو و هضم لایه ژلاتینی از فیلم‌های عکاسی از خود نشان داد. همچنین، تولید آنزیم پروتئاز با بهره گرفتن از فرآیند تخمیر حالت جامد در بیوراکتور و فلاسک بررسی و دو سامانه از نظر میزان تولید آنزیم با یکدیگر مقایسه شدند.
واژه‌های کلیدی: پروتئاز، سبوس گندم، تخمیر حالت جامد، بیوراکتور سینی‌دار، Bacillus. licheniformis
فهرست مطالب
فصل۱  ۱
مقدمه  ۱
۱-۱. مقدمه ۲
۱-۲. تعریف آنزیم ۲
۱-۳. تاریخچه آنزیم ۲
۱-۴. ساختار آنزیم ۴
۱-۵. تقسیم‌بندی آنزیم‌ها ۵
۱-۶. تاریخچه آنزیم پروتئاز. ۶
۱-۷. عملکرد پروتئازها ۶
۱-۸. تخمیرحالت جامد ۷
۱-۹. ضرورت انجام پروژه ۸
۱-۱۰. اهداف این پروژه ۸
فصل۲ مروری بر منابع مطالعاتی  ۱۰
۲-۱. مقدمه ۱۱
۲-۲. پروتئازها ۱۱
۲-۳. منابع پروتئازها ۱۲
۲-۳-۱. پروتئازهای گیاهی. ۱۲
۲-۳-۲. پروتئازهای حیوانی. ۱۳
۲-۳-۳. پروتئازهای میکروبی. ۱۳
۲-۴. تقسیم بندی پروتئازها ۱۶
۲-۵. پروتئازهای قلیایی. ۱۹
۲-۶. مکانیزم عمل پروتئازها ۲۲
۲-۷. کاربردهای صنعتی آنزیم پروتئاز. ۲۲
۲-۷-۱. صنعت مواد شوینده ۲۳
۲-۷-۲. صنایع غذایی. ۲۴
۲-۷-۳. صنعت چرم ۲۵
۲-۷-۴. صنعت عکاسی. ۲۶
۲-۷-۵. صنایع دارویی. ۲۶
۲-۷-۶. مدیریت محیط زیست ۲۷
۲-۸. تولید آنزیم پروتئاز. ۲۷
۲-۹. تخمیر حالت غوطه ور. ۲۸
۲-۹-۱. تخمیر حالت جامد ۲۹
۲-۹-۲. مقایسه سیستم‌های تخمیر جامد و غوطه‌ور. ۲۹
۲-۹-۳. انتقال جرم در تخمیر حالت جامد ۳۰
۲-۹-۴. عملیات انتقال جرم در مقیاس ماکرو. ۳۱
۲-۹-۵. عملیات انتقال جرم در مقیاس میکرو. ۳۲
۲-۹-۶. انتقال اکسیژن. ۳۲
۲-۹-۷. نفوذ آنزیم‌ها ۳۳
۲-۹-۸. جنبه‌های انتقال حرارت ۳۴
۲-۹-۹. میکروارگانیزم‌های مورد استفاده در تخمیر حالت جامد ۳۵
۲-۹-۱۰. کاربردهای تخمیر حالت جامد ۳۷
۲-۹-۱۱. آنزیم‌های بدست آمده از فرآیند تخمیر جامد ۳۸
۲-۱۰. طراحی بیوراکتور. ۳۹
۲-۱۱. انواع بیوراکتورهای مورد استفاده در تخمیر حالت جامد ۴۰
۲-۱۱-۱. بیوراکتورهای سینی‌دار. ۴۱
۲-۱۱-۲. بیوراکتورهای بستر‌پرشده ۴۲
۲-۱۱-۳. بیوراکتورهای استوانه ای‌دوار. ۴۳
۲-۱۱-۴. بیوراکتورهای بستر‌سیال. ۴۵
۲-۱۲. مراحل عمومی برای انجام فرآیند SSF در داخل بیوراکتور. ۴۶
۲-۱۳. عوامل مؤثر در تولید پروتئاز در فرآیند SSF در داخل بیوارکتور. ۴۷
فصل۳ مواد و روشها ۴۸
۳-۱. مقدمه ۴۹
۳-۲. تجهیزات مورد استفاده ۴۹
۳-۳. تعیین مشخصات سوبسترا ۵۰
۳-۳-۱. محاسبه میزان خاکستر. ۵۰
۳-۳-۲. محاسبه میزان رطوبت ۵۱
۳-۳-۳. محاسبه میزان قند موجود در سوبسترا ۵۱
۳-۳-۴. محاسبه میزان پروتئین. ۵۲
۳-۳-۵. تعیین درصد مواد استخراجی. ۵۴
۳-۳-۶. تعیین درصد سلولز. ۵۴
۳-۳-۷. تعیین درصد لیگنین. ۵۵
۳-۳-۸. تعیین درصد همی‌سلولز. ۵۵
۳-۳-۹. محاسبه اندازه ذرات سوبسترا ۵۵
۳-۴. میکروارگانیسم و محیط کشت ۵۶
۳-۴-۱. انتخاب میکروارگانیسم ۵۶
۳-۴-۲. مشخصات میکروارگانیسم ۵۷
۳-۴-۳. محیط کشت ۵۷
۳-۴-۴. تهیه مایه تلقیح. ۵۹
۳-۴-۵. منحنی رشد باکتری. ۶۰
۳-۴-۶. تعیین pH بهینه باکتری. ۶۰
۳-۵. تخمیر حالت جامد ۶۱
۳-۶. نمونه‌گیری و استخراج آنزیم از سوبسترای تخمیر‌یافته ۶۳
۳-۷. فعالیت پروتئاز. ۶۴
۳-۷-۱. منحنی استاندارد تیروزین. ۶۵
۳-۸. بررسی تأثیر پارامترهای مختلف بر روی تولید آنزیم پروتئاز در بیوراکتور سینی‌دار  ۶۶
۳-۸-۱. تأثیر نوع سوبسترای جامد ۶۶
۳-۸-۲. تأثیر مدت زمان تخمیر. ۶۷
۳-۸-۳. اثر دما ۶۷
۳-۸-۴. تأثیر pH. 67
۳-۸-۵. اثر پارامترهای مختلف بر روی استخراج آنزیم ۶۸
۳-۸-۶. تأثیر رطوبت اولیه سوبسترا ۶۸
۳-۸-۷. تأثیر رطوبت داخلی راکتور. ۶۸
۳-۸-۸. تأثیر اندازه ذرات ۶۸
۳-۸-۹. تأثیر میزان تلقیح. ۶۹
۳-۸-۱۰. تأثیر غنی‌سازی سوبسترا با منابع کربنی و نیتروژنی. ۶۹
۳-۸-۱۱. تأثیر pH بر فعالیت و پایداری آنزیم تولیدی. ۶۹
۳-۸-۱۲. تأثیر دما بر فعالیت و پایداری آنزیم تولیدی. ۷۰
۳-۹. کاربردهای آنزیم تولیدی. ۷۱
۳-۹-۱. افزودنی به مواد شوینده ۷۱
۳-۹-۲. پردازش چرم ۷۱
۳-۹-۳. هیدرولیز لایه ژلاتینی فیلم‌های عکاسی و آزاد سازی نقره ۷۲
۳-۱۰. مقایسه تولید آنزیم پروتئاز در بیوراکتور و فلاسک. ۷۲
فصل۴ نتایج و تفسیر آنها ۷۳
۴-۱. مقدمه ۷۴
۴-۲. محاسبه خصوصیات سبوس گندم ۷۴
۴-۳. منحنی رشد باکتری. ۷۵
۴-۴. pH بهینه رشد باکتری. ۷۵
۴-۵. بررسی پارامترهای مختلف بر تولید پروتئاز. ۷۶
۴-۵-۱. تأثیر مدت زمان تخمیر. ۷۶
۴-۵-۲. بررسی تأثیر نوع سوبسترای جامد ۷۸
۴-۵-۳. بررسی پارامترهای مؤثر بر استخراج پروتئاز. ۷۹
۴-۵-۴. تأثیر pH ابتدایی. ۸۲
۴-۵-۵. بررسی دمای داخل بیوراکتور. ۸۲
۴-۵-۶. تأثیر رطوبت ابتدایی سوبسترا ۸۴
۴-۵-۷. تأثیر رطوبت داخلی بیوراکتور. ۸۵
۴-۵-۸. تأثیر اندازه ذرات ۸۶
۴-۵-۹. تاثیر میزان مایه تلقیح. ۸۷
۴-۵-۱۰. بررسی تأثیر غنی سازی سوبسترا با منابع کربنی و نیتروژنی. ۸۷
۴-۶. بهینه سازی شرایط فعالیت پروتئازی آنزیم ۹۲
۴-۶-۱. تعیین pH بهینه فعالیت آنزیم ۹۲
۴-۶-۲. تعیین دمای بهینه فعالیت آنزیم ۹۴
۴-۶-۳. تعیین pH پایداری آنزیم ۹۵
۴-۶-۴. تعیین دمای بهینه پایداری آنزیم ۹۶
۴-۷. کاربردهای آنزیم پروتئاز قلیایی حاصل از B.licheniformis 97
۴-۷-۱. عملکرد پروتئاز قلیایی به عنوان افزدونی به شوینده ۹۷
۴-۷-۲. موزدایی از پوست ۹۸
۴-۷-۳. هیدرولیز لایه ژلاتینی فیلم‌های X-Ray. 99
۴-۸. مقایسه تولید آنزیم پروتئاز در بیوراکتور و فلاسک. ۱۰۰
فصل۵ نتیجهگیری و پیشنهادها ۱۰۳
۵-۱. نتیجه‌گیری. ۱۰۴
۵-۲. پیشنهادها ۱۰۶
فهرست اشکال
فصل۱  ۱
مقدمه  ۱
شکل۱-۱. مکانیزم اثر آنزیم بر روی انرژی واکنش ۳
شکل۱-۲. شماتیکی از مدل‌های ارائه شده برای جایگاه فعال آنزیمی، (۱): مدل قفل و کلید، (۲): مدل القایی  ۴
شکل۱-۳. نقش پروتئازها در کاتالیز کردن پیوندهای پپتیدی ۷
فصل۲ مروری بر منابع مطالعاتی  ۱۰
شکل۲-۱. ارتباط فرآیندهای میکرو و ماکرو در فرآیند تخمیر حالت جامد ۳۲
شکل۲-۲. بیوراکتور سینی‌دار. ۴۲
شکل۲-۳. بیوراکتور بسترپرشده بصورت افقی و عمودی ۴۳
شکل۲-۴. بیوراکتور استوانه ای‌دوار. ۴۴
شکل۲-۵. بیوراکتور بستر‌سیال. ۴۵
فصل۳ مواد و روشها ۴۸
شکل۳-۱. منحنی استاندارد گلوکز. ۵۲
شکل۳-۲. منحنی استاندارد پروتئین. ۵۳
شکل۳-۳. تصویر میکروسکوپی از باکتری B. licheniformis 56
شکل۳-۴. نمایی از بیوراکتور مور استفاده جهت تولید پروتئاز در تخمیر حالت جامد ۶۲
شکل۳-۵. دیاگرام شماتیک بیوراکتور سینی‌دار. (۱) پمپ، (۲) نمایشگر و کنترلر دما و رطوبت، (۳) نازل                                                                                                  (۴) المنت حرارتی، (۵) سینی، (۶) فن، (۷) حسگر دما، (۸) حسگر رطوبت ۶۳
شکل۳-۶. نمونه ۵گرمی سوبسترای تخمیریافته، (۱) : قبل از تخمیر، (۲): پس از تخمیر. ۶۴
شکل۳-۷. منحنی استاندارد تیروزین. ۶۶
فصل۴ نتایج و تفسیر آنها ۷۳
شکل۴-۱. منحنی رشد باکتری ۷۵
شکل۴-۲. تأثیر زمان تخمیر بر روی فعالیت پروتئاز تولیدی از B.licheniformis 77
شکل۴-۳. تأثیر زمان تخمیر بر روی محتوای پروتئین کل. ۷۸
شکل۴-۴. تأثیر نوع سوبسترای جامد بر فعالیت پروتئاز تولیدی از B.licheniformis 79
شکل۴-۵. تأثیر محلول های مختلف بر استخراج پروتئاز تولیدی از B.licheniformis 80
شکل۴-۶. تأثیر حجم بافر بر فعالیت و پروتئین کلی پروتئاز تولیدی از B.licheniformis 81
شکل۴-۷. تأثیر زمان اقامت در شیکر بر فعالیت و پروتئین کلی پروتئاز تولیدی از B.licheniformis 81
شکل۴-۸. اثر pH ابتدایی بر فعالیت و پروتئین کلی پروتئاز تولیدی از B.licheniformis 82
شکل۴-۹. تأثیر دمای داخل بیوراکتور بر فعالیت و پروتئین کلی پروتئاز تولیدی از B.licheniformis 83
شکل۴-۱۰. تأثیر رطوبت ابتدایی سوبسترا بر فعالیت و پروتئین کلی پروتئاز تولیدی از B.licheniformis 84
شکل۴-۱۱. اثر رطوبت داخلی بیوراکتور بر فعالیت و پروتئین کلی پروتئاز تولیدی از B.licheniformis 85
شکل۴-۱۲. تأثیر اندازه ذرات سوبسترا بر فعالیت و پروتئین کلی پروتئاز تولیدی از B.licheniformis 86
شکل۴-۱۳. تأثیر میزان مایه تلقیح بر فعالیت و پروتئین کلی پروتئاز تولیدی از B.licheniformis 87
شکل۴-۱۴. تأثیر منابع کربنی مکمل بر تولید آنزیم پروتئاز تولیدی از B.licheniformis 89
شکل۴-۱۵. تأثیر غلظت های مختلف سبوس برنج بر تولید آنزیم پروتئاز تولیدی از B.licheniformis 89
شکل۴-۱۶. تأثیر منابع نیتروژنی مکمل بر تولید آنزیم پروتئاز تولیدی از B.licheniformis 91
شکل۴-۱۷. تأثیر غلظت های مختلف آرد ذرت بر تولید آنزیم پروتئاز تولیدی از B.licheniformis 91
شکل۴-۱۸. تأثیر pH بر فعالیت آنزیم پروتئاز پروتئاز تولیدی از B.licheniformis 93
شکل۴-۱۹. اثر دما بر فعالیت آنزیم پروتئاز. ۹۴
شکل۴-۲۰. اثر pH بر پایداری آنزیم پروتئاز پروتئاز تولیدی از B.licheniformis 95
شکل۴-۲۱. اثر دما بر پایداری آنزیم پروتئاز پروتئاز تولیدی از B.licheniformis 96
شکل۴-۲۲. اثر زمان بر پایداری حرارتی آنزیم پروتئاز پروتئاز تولیدی از B.licheniformis 97
شکل۴-۲۳. عملکرد پروتئاز قلیایی تولیدی از B.licheniformis بعنوان افزودنی به شوینده، (۱) کنترل،                                               (۲) اثر شوینده تجاری بر روی پارچه لکه شده، (۳) اثر آنزیم و شوینده تجاری بر روی پارچه لکه شده ۹۸
شکل۴-۲۴. موزدایی آنزیمی از پوست گاو با بهره گرفتن از پروتئاز قلیایی تولیدی از B.licheniformis                                               (۱) کنترل (۲) نمونه پس از ۱۶ ساعت انکوباسیون در دمای اتاق. ۹۸
شکل۴-۲۵. هیدرولیز آنزیمی لایه ژلاتینی با بهره گرفتن از پروتئاز قلیایی تولیدی از B.licheniformis                                            (۱) کنترل، (۲) فیلم عکاسی پس از هیدرولیز آنزیمی. ۹۹
شکل۴-۲۶. تأثیر زمان بر تولیدآنزیم پروتئاز در بیوراکتور و فلاسک. ۱۰۱
شکل۴-۲۷. تأثیر دما بر تولید آنزیم پروتئاز در بیوراکتور و فلاسک. ۱۰۱
شکل۴-۲۸. تأثیر رطوبت ابتدایی بر تولید آنزیم پروتئاز در بیوراکتور و فلاسک. ۱۰۲
شکل۴-۲۹. تأثیر محرک‌های پروتئینی مختلف بر تولید آنزیم پروتئاز در بیوراکتور و فلاسک. ۱۰۲
فصل۵ نتیجهگیری و پیشنهادها ۱۰۳
فهرست جداول
فصل۱  ۱
مقدمه  ۱
جدول۱-۱. گروه‌‌های آنزیمی و واکنش‌های مرتبط. ۵
فصل۲ مروری بر منابع مطالعاتی  ۱۰
جدول۲-۱. پروتئاز‌های قلیایی باکتریایی تجاری، شرکت تولید کننده، منابع و کاربردهای صنعتی  ۱۵
جدول۲-۲. برخی از خواص کارلسبرگ و BPN. 19
جدول۲-۳. دمای بهینه و پایداری حرارتی پروتئازهای قلیایی حاصل از گونه های باسیلوس ۲۰
جدول۲-۴. pH بهینه پروتئازهای قلیایی تولید شده توسط گونه باسیلوس ۲۱
جدول۲-۵. میکروارگانیسم‌های مورد استفاده در فرآیندهای تخیمری حالت جامد ۳۶
جدول۲-۶. کاربردهای تخمیر حالت جامد ۳۷
جدول۲-۷. آنزیم‌های تولید شده در فرآیند تخمیر حالت جامد ۳۸
جدول۲-۸. انواع بیوراکتورها در فرآیند تخمیر جامد و محصولات تولیدی ۴۶
فصل۳ مواد و روشها ۴۸
جدول۳-۱. ترکیب محیط کشت مایع. ۵۸
جدول۳-۲. ترکیبات مایه تلقیح. ۶۰
فصل۴ نتایج و تفسیر آنها ۷۳
جدول۴-۱. خصوصیات فیزیکی و شیمیایی سبوس گندم ۷۴
جدول۴-۲. pH بهینه رشد باکتری ۷۶
جدول۴-۳. تأثیر سبوس برنج (۱%) و آرد ذرت (۲%) بر تولید پروتئاز در بیواکتور سینی دار. ۹۲
فصل۵ نتیجهگیری و پیشنهادها ۱۰۳
فهرست علائم اختصاری
دور بر دقیقه rpm    
مولار . M
میلی لیتر ml
میلی گرم . mg
تعداد صفحه :۱۳۵
قیمت : ۱۴۷۰۰ تومان

بلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد

و در ضمن فایل خریداری شده به ایمیل شما ارسال می شود.

پشتیبانی سایت :        ****       [email protected]

در صورتی که مشکلی با پرداخت آنلاین دارید می توانید مبلغ مورد نظر برای هر فایل را کارت به کارت کرده و فایل درخواستی و اطلاعات واریز را به ایمیل ما ارسال کنید تا فایل را از طریق ایمیل دریافت کنید.