Get a site

پایان نامه بررسی تاثیر آلدوسترون در بهبود کیفی جنین های حاصل از تخمک های منجمد شده (انجماد شیشه ای) گوسفند

پایان نامه بررسی تاثیر آلدوسترون در بهبود کیفی جنین های حاصل از تخمک های منجمد شده (انجماد شیشه ای) گوسفند

پایان نامه رشته زیست شناسی

گرایش : سلولی-مولکولی

دانشگاه آزاد اسلامی

واحد علوم دارویی

دانشکده فناوری های نوین، گروه زیست شناسی

پایان نامه برای دریافت درجه کارشناسی ارشد  ((M.Sc))

گرایش: سلولی-مولکولی

عنوان:

بررسی تاثیر آلدوسترون در بهبود کیفی جنین های

حاصل از تخمک های منجمد شده (انجماد شیشه ای) گوسفند

استاد راهنما:

  جناب آقای دکتر محمد مهدی نادری

 

اساتید مشاور:

جناب آقای دکتر ابوالفضل شیرازی

سرکار خانم دکتر طاهره ناجی

 سال تحصیل:۹۲-۱۳۹۱

فهرست
عنوان                                                                                                    صفحه

    خلاصه فارسی۱
   فصل اول: کلیات
مقدمه ۲
۱-۱-  بیان مسئله۴
۱- ۲ -اهداف  پژوهش۵
۱-۳-  ضروریت انجام تحقیق۶
۱-۴- تولید جنین در شرایط in vivo
۱-۴-۱- روند ایجاد سلول جنسی ماده.۶
۱-۴-۱-۱- ویژگی­های اووسیت ثانویه.۸
۱-۴-۲- روند ایجاد سلول جنسی نر۹
۱-۴-۳- لقاح.۱۰
۱-۴-۴- تسهیم۱۲
۱-۵- تولید جنین در شرایط in vitro
۱-۵-۱- بلوغ آزمایشگاهی تخمک (IVM).15
۱-۵-۲- ظرفیت پذیری اسپرم۱۹
۱-۵-۳- لقاح در شرایط آزمایشگاهی(IVF).21
۱-۵-۴-کشت جنین در شرایط آزمایشگاهی(IVC).23
۱-۶- مقایسه جنین­های طبیعی با جنین­های آزمایشگاهی۲۶
۱-۷- انجماد
۱-۷-۱- مراحل اصلی انجماد۳۰
۱-۷-۲- راه­های کاهش اثرات زیانبار مواد محافظت کننده.۳۰
۱-۷-۳- روش­های انجماد۳۰
۱-۷-۳-۱- انجماد شیشه­ای۳۱
۱-۷-۳-۱-۱- عوامل تکنیکی موثر در انجماد شیشه­ای۳۲
۱-۷-۳-۱-۱-۱- زمان تعادل و آبگیری۳۲
۱-۷-۳-۱-۱-۲- سرعت سرد کردن۳۲
۱-۷-۳-۱-۱-۳- سرعت گرم کردن.۳۵
۱-۷-۳-۱-۱-۴- مواد محافظ انجمادی.۳۵
۱-۷-۳-۱-۱-۵- نقش ضد یخ­ها.۳۶
۱-۷-۳-۱-۱-۶- ذوب و آبدهی. ۳۶
۱-۸- آلدوسترون.۳۷
۱-۸-۱- خصوصیات.۳۷
۱-۸-۲- عملکرد.۳۸
۱-۹- ارزیابی کیفیت رویان۴۱
۱-۱۰- سلول­های رویانی۴۳
فصل دوم: مروری بر متون گذشته
۲-۱- اثرات انجماد بر روی تخمک.۴۶
۲-۲- اثر روش انجماد شیشه­ای۴۷
۲-۳- بیان زیر واحد­های پمپ Na/K ATpase در تخمک و جنین.۴۸
۲-۴- پمپ  Na/K ATpase .49
۲-۵- آکواپورین­ها۵۱
۲-۶- هچ یا تفریخ۵۲
۲-۷- فعال شدن ژنوم رویانی۵۵
۲-۸- متابولیسم رویان۵۶
۲-۹- نقش آلدوسترون در بیان پروتیین Na/K ATpase58
فصل سوم: مواد و روش­ها
۳-۱- تولید جنین های حاصل از لقاح خارج رحمی (IVF)
۳-۱-۱- جمع‌آوری تخمدان‌ها از کشتارگاه و استحصال تخمک‌ها از مایع فولیکولی.۶۱
۳-۱-۲- بلوغ آزمایشگاهی تخمک‌ها (IVM).62
۳-۱-۳- لقاح داخل آزمایشگاهی (IVF).63
۳-۱-۳-۱- آماده سازی اووسیت­های بالغ شده برای لقاح.۶۳
۳-۱-۳-۲- آماده سازی اسپرم۶۳
۳-۱-۴- کشت داخل آزمایشگاهی جنین های حاصل از(IVF).64
۳-۱-۵- تازه کردن محیط کشت جنین‌ها۶۵
۳-۲- تهیه محلول‌های انجمادی.۶۵
۳-۳- مراحل انجام روند انجماد شیشه ای۶۶
۳-۴- محیط ذوب.۶۶
۳-۵- گروه­های آزمایشی و طراحی مطالعه.۶۶
۳-۶- ارزیابی جنین‌ها
۳-۶-۱- ارزیابی کیفی جنین‌ها با بهره گرفتن از رنگ‌آمیزی افتراقی.۶۸
۳-۷- ایمونوسایتوشیمی پروتئین­های سطحی جنین های گوسفندی(Sheep embryo ICC)70
فصل چهارم: نتایج
۴-۱- تخمک­های منجمد شده
۴-۱-۱- گروه آزمایشی اول، افزودن آلدوسترون به محیط IVM تخمک­های
منجمد-ذوب شده در مرحله GV.82
۴-۱-۲- گروه آزمایشی دوم، افزودن آلدوسترون در روز چهارم
جنینی (D4)، به محیط کشت جنین­های حاصل از تخمک­های منجمد-ذوب شده۸۲
۴-۱-۳- گروه آزمایشی سوم، افزودن آلدوسترون در طی IVM،
ومتعاقباً انجماد تخمک ها در مرحله MII.83
۴-۱-۴- گروه آزمایشی چهارم، یا گروه کننرل۸۳
۴-۲- تخمک های منجمد نشده
۴-۲-۱- گروه آزمایشی پنجم، افزودن آلدوسترون به محیط IVM تخمک­های غیر منجمد.۸۵
۴-۲-۲- گروه آزمایشی ششم، افزودن آلدوسترون در روز چهارم جنینی (D4)، به محیط کشت جنین­های حاصل از تخمک­های غیر منجمد۸۵
۴-۲-۳- گروه آزمایشی هفتم، یا گروه کنترل۸۶
۴-۳-
فصل پنجم: بحث و پیشنهادات

بحث.۸۹
نتیجه ­گیری. ۹۴
پیشنهادات. ۹۵
منابع. ۹۶
خلاصه انگلیسی۱۱۳

 

 

 
 
فهرست جداول
عنوان                                                                                                    صفحه
جدول ۳-۱- ترکیبات محیط HEPES buffered M199 73
جدول ۳-۲- ترکیبات محیط Bicarbonate buffered M199. 73
جدول ۳-۳- ترکیبات محیطIVF medium “Fert. TALP”. ۷۴
جدول ۳-۴- ترکیبات محیطRinsing medium “R. TALP”. ۷۴
جدول ۳-۵- ترکیبات محیط Sperm medium “S. TALP”. ۷۵
جدول ۳-۶- ترکیبات محیط H-SOF 75
جدول ۳-۷- ترکیبات محیطی IVC- SOF. 76
جدول ۳-۸- Medium A. 76
جدول ۳-۹- مواد شیمیایی و تجهیزات ۷۷
جدول ۴-۱- حضور آلدوسترون در محیط کشت در زمانIVM  یا روز چهارم
کشت جنینی، در تکامل جنین حاصل از تخمک های منجمد-ذوب شده۸۳
جدول ۴-۲- حضور آلدوسترون در محیط کشت  در زمانIVM  یا روز چهارم
کشت جنینی، در تکامل جنین حاصل از تخمک های تازه. ۸۶
جدول ۴-۳- حضور آلدوسترون در محیط کشت در زمانIVM  یا روز چهارم
کشت جنینی و تأثیر آن بر تعدا سلول های در تعدادی از سلول­های بلاستوسیست در تقسیم جنین­های حاصل از تخمک­های تازه. ۸۶

                                                                                       
 
 
فهرست نمودارها
عنوان                                                                                                    صفحه
نمودار ۴-۱- تاثیر آلدسترون روی بیان زیرواحد های α۱ و β۱ پمپ  ATPase سدیم
و پتاسیم در مدت IVM   یا  IVC – روز چهارم- در محیط کشت سلولهای
بلاستوسیت. نوارها با حروف مختلف نشان دهنده تفاوت معنی­دار می­باشد. ۸۷

فهرست اشکال
عنوان                                                                                                    صفحه
شکل ۱-۱- روند انجام اووژنزیزیس و اسپرماتوژنزیس ۱۰
شکل ۱-۲- روند انجام لقاح از زمان رشد تخمک ۱۱
شکل ۱-۳- تصاویر شماتیک مراحل نفوذ اسپرم به داخل تخمک. ۲۱
شکل ۱- ۴- تصویر شماتیک روند تکامل جنین ۲۴
شکل ۱-۵- دو مکانیسم عملکرد مولکولی آلدوسترون. ۳۸
شکل ۱- ۶- سیگنال های آلدوسترون. ۳۹
شکل ۱-۷- میزان اتصال سلول – سلول در توده سلولی رویان. ۴۴
شکل ۲-۱- اتصالات سلولی در رویان در حال تقسیم ونقش آنها در تشکیل حفره
بلاستوسل و تعیین موقعیت سلول­های ترفکتودرم و توده داخلی ۵۰
شکل۲-۲- فرایند تشکیل حفره بلاستوسل. ۵۱
شکل۲-۳-  ساز وکار کنترل فرایند هچ شدن بلاستوسیست ۵۳
شکل ۲-۴- پدیدۀ فعال شدن ژنوم رویانی ۵۶
شکل ۳-۱- رنگ آمیزی افتراقی بلاستوسیت های مشتق از تخمک های منجمد. ۶۹
شکل ۳-۲- رنگ آمیزی ایمونوسیتوشیمی زیر واحد های α۱ و β۱ پمپ Na+/K+ ATPase. 72
شکل ۴-۱- تصاویر مورولا و بلاستوسیست تولید شده در آزمایشگاه
جنین شناسی پژوهشگاه ابن سینا. ۸۴
شکل ۴-۲- تصاویر بلاستوسیست های در حال تفریخ در آزمایشگاه
جنین شناسی پژوهشگاه ابن سینا. ۸۴

چکیده
هدف: هدف از این مطالعه بررسی تآثیر آلدوسترون در افزایش توانمندی تکاملی تخمک های منجمد شده گوسفند با افزودن آلدوسترون در مرحله بلوغ تخمک و مرحله کشت جنینی می باشد.
مواد و روش ها: تخمک های حاصل از تخمدان های کشتارگاهی، بطور تصادفی به شش گروه آزمایشی تقسیم شدند: گروه های یک و دو: بلوغ تخمک های (IVM) منجمد شده و تازه در حضور آلدسترون و متعاقباً لقاح آزمایشگاهی تخمک ها (IVF) و کشت جنین های حاصله (IVC) (به ترتیب گروه هایVit-IVM  و IVM). گروه های سه و چهار: IVM و IVF تخمک های منجمد شده و تازه، و متعاقباً IVC جنین های حاصله در حضور آلدوسترون در روز چهارم (D4) کشت جنینی (به ترتیب گروه های Vit-D4 و D4).  گروه های پنجم و ششم: IVM، IVF و IVC تخمک های منجمد شده ( Vit-Cont) و تازه (Fresh-Cont) بدون حضور آلدوسترون. جنین ها در مراحل مورولا و بلاستوسیت، توسط آنتی بادی های اولیه بر علیه زیر واحدهایα۱  و β۱ پمپ Na+/K+/ATPase رنگ آمیزی ایمونوسیتوشیمی شدند.
نتایج: میزان تفریخ در گروه هایی که در IVM و یا IVC آنها آلدوسترون افزوده شده بود، در هر دو گروه تخمک های منجمد شده و تازه (به ترتیب گروه های Vit-IVM، IVM، Vit-D4 و D4) در مقایسه با گروه های کنترل (به ترتیب Vit-Cont. و Fresh-Cont.) به طور معنی داری بیشتر بود. میزان بیان تحت واحد β۱ پمپ Na+/K+/ATPase، در گروه های Vit-D4 و D4 به طور معنی داری بیشتر از سایر گروه های بود. همچنین نسبت ICM/Total نیز به طور معنی داری در گروه IVM بیشتر از سایر گروه ها بود.
بحث: به طور خلاصه، اضافه نمودن آلدسترون به محیط های کشت IVM و IVC می تواند موجب افزایش معنی دار میزان تفریخ در هر دو گروه تخمک های منجمد شده و تازه گردد. این افزایش میزان تفریخ ممکن است با میزان بیان بیشتر زیر واحد β۱ پمپ Na+/K+/ATPase، که احتمالاً توسط افزودن آلدوسترون به محیط کشت القا گردیده است، در ارتباط باشد.
کلید واژه: آلدوسترون، گوسفند، جنین، تکامل، Na+/K+/ATPase، بیان
 
 
مقدمه و معرفی طرح
در سال­های اخیرعلل مختلفی از قبیل بالا رفتن سن ازدواج، تعییر شیوه زندگی، عوامل عفونی و شیمیایی، اشعه و شیمی درمانی، مسائل ژنتیکی و یائسگی زود رس منجر به ناباروری زوج­های بسیاری شده و لذا انجماد و نگهداری تخمک اقدام اساسی در حفظ قدرت باروری و درمان ناباروری به شمار می­رود. با توجه به ضرورت حفظ و نگهداری تخمک در روش­های کمک باروری[۱](ART) تلاش­های زیادی جهت انجماد و نگهداری تخمک­ها صورت گرفته است، لیکن تا­کنون روش قابل اعتمادی در انجماد تخمک که بتواند میزان بالایی از زنده مانی تخمک­ها را نشان دهد گزارش نشده است. علی رغم بررسی های متعدد صورت گرفته بر روی تغییرات مورفولوژیک، فراساختاری، فیزیولوژیک و عملکردی تخمک های منجمد- ذوب شده، هنوز اطلاعات اندکی در خصوص وقوع تغییرات ملکولی و بیوشیمیایی ­ایجاد شده در تخمک های مذکور و نیز الگوی بیان پروتیین های مرتبط با توان تکاملی تخمک ها پس از لقاح، به چشم می خورد. با توجه به مطرح بودن این گونه حیوانی به عنوان حیوان مدل انسان برای مطالعات تخمدان و تخمک، خطر انقراض برخی از نژادهای این گونه جانوری، اهمیت این گونه حیوانی از نظر اقتصادی (فراورده های دامی)، نقش آن به عنوان بیوراکتور در مطالعات مرتبط با تولید حیوان تراریخته و نیز عدم انجام مطالعه ای در خصوص بررسی ارتباط بین تجویز آلدوسترون و وضعیت بیان آنزیم Na+/K+/ATPase در روند تشکیل بلاستوسیست، در مطالعه حاضر به بررسی تاثیرآلدوسترون در بهبود کیفی تخمک های منجمد شده پرداخته خواهد شد.
بدین منظور تخمک های استحصال شده از تخمدان های کشتارگاهی گوسفند، در مرحله GV از تقسیمات میوزی به روش کرایوتاپ و با بهره گرفتن از روش انجماد شیشه ای منجمد و پس از گذشت یک هفته ذوب شده و پس از لقاح، مراحل تکاملی آنها در شرایط آزمایشگاهی مورد بررسی قرار می گیرد.
[۱] – Asisted  Reproductive Technology
تعداد صفحه : ۱۲۸
قیمت : ۱۴۷۰۰ تومان

بلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد

و در ضمن فایل خریداری شده به ایمیل شما ارسال می شود.

پشتیبانی سایت :        ****       [email protected]

در صورتی که مشکلی با پرداخت آنلاین دارید می توانید مبلغ مورد نظر برای هر فایل را کارت به کارت کرده و فایل درخواستی و اطلاعات واریز را به ایمیل ما ارسال کنید تا فایل را از طریق ایمیل دریافت کنید.

***  **** ***