Get a site

پایان نامه بررسی میزان آپوپتوز و قطعه قطعه شدن DNA اسپرم انسانی پس از روش Swim-up در زمان های مختلف

پایان نامه بررسی میزان آپوپتوز و قطعه قطعه شدن DNA اسپرم انسانی پس از روش Swim-up در زمان های مختلف

پایان نامه رشته زیست شناسی

گرایش : سلولی و مولکولی

دانشگاه مازندران

دانشکده علوم پایه

 

پایان نامه ی دوره ی کارشناسی ارشد در رشته زیست شناسی سلولی و مولکولی

 

موضوع:

بررسی میزان آپوپتوز و قطعه قطعه شدن DNA اسپرم انسانی پس از روش   Swim-up در زمان های مختلف

 

اساتید راهنما:

دکتر فاطمه رودباری

دکتر محمد علی خلیلی

 

بهمن ماه ۱۳۹۱

(در فایل دانلودی نام نویسنده موجود است)

چکیده
یکی از علت های شکست و عدم موفقیت در تکنیک های کمک باروری(ART) قطعه قطعه شدن DNA اسپرم انسانی است، که ممکن است با انکوباسیون طولانی مدت اسپرم در دمای ۳۷ درجه سانتی گراد به وجود آید. لذا در این مطالعه میزان قطعه قطعه شدن و آپوپتوز DNA اسپرم انسانی بعد از آماده سازی به روش Direct swim-up در زمان های مختلف انکوباسیون به وسیله تست SCD و تکنیک TUNEL مورد ارزیابی قرار گرفت.
در این مطالعه آینده نگر، بیست ویک نمونه ی اسپرم نرمال مورد مطالعه قرار گرفت. برای بررسی مورفولوژی اسپرم از رنگ آمیزی  Papanicolaou و قابلیت حیات اسپرم از رنگ آمیزی Eosin-Nigrosin  استفاده شد. نمونه ها در دمای ۳۷ درجه سانتی گراد بعد از آماده سازی به روش Direct swim-up در زمان های مختلف انکوبه شدند. قطعه قطعه شدن DNA در فواصل زمانی مختلف (۳،۲،۱،۰ ساعت) با بهره گرفتن از تست SCD مورد بررسی قرار گرفت. اسپرم های دارای هاله بزرگ و متوسط، DNA سالم داشتند و اسپرم هایی که دارای هاله کوچک و بدون هاله بودند DNA قطعه قطعه شده داشتند. میزان آپوپتوز نیز به وسیله تکنیک TUNEL مورد ارزیابی قرار گرفت.
میانگین مورفولوژی نرمال و حرکت پیشرونده اسپرم بعد از آماده سازی به روش Direct swim-up  ۵۳/۲±۳۳/۷۲ و ۰۲/۱±۱۰/۹۰ بوده است. میزان قطعه قطعه شدن DNA اسپرم به میزان معنی داری افزایش یافت بعد از دو ساعت (۹۳۵/۰±۸۱/۸، ۰۰۴/۰ P=) و بعد از سه ساعت (۸۹۴/۰±۷۶/۱۰، ۰۰۰۱/۰ P=) انکوباسیون نسبت به زمان صفر (۸۰۹/۰±۳۸/۴) بوده است. همچنین میزان آپوپتوز DNA اسپرم در زمان دو ساعت انکوباسیون نسبت به زمان صفر  (۸۶۴/۰±۱۹/۹، ۰۰۸/۰ P=) و نیز زمان سه ساعت نسبت به زمان یک ساعت ( ۷/۰±۹۷/۱۰، ۰۰۲/۰ P=) انکوباسیون معنی دار شده است.
در نهایت نتیجه ای که ما به آن دست یافته ایم نشان می دهد که انکوباسیون اسپرم نرمال در دمای ۳۷ درجه سانتی گراد که به روش Direct swim-up آماده شده برای استفاده در تکنینک های کمک باروری (ART) باید زمانی کمتر از دو ساعت باشد.
واژه های کلیدی:
اسپرم نرمال، قطعه قطعه شدن DNA، انکوباسیون، تست SCD، تکنیک TUNEL.

فهرست مطالب
عنوان                                                                                                          صفحه
فصل اول- مقدمه۱
۱-۱- روش های کمک باروری۲
۱-۲- ناباروری.۵
۱-۳- تولید اسپرم .۵
۱-۴- مایع انزالی.۶
۱-۴-۱- آنالیز مایع انزالی.۷
۱-۵- پارامترهای اسپرم.۱۰
۱-۵-۱- مورفولوژی.۱۰
۱-۵-۲- تحرک اسپرم۱۲
۱-۵-۳- درجه بندی تحرک اسپرم ۱۴
۱-۵-۴- قابلیت حیات اسپرم۱۴
۱-۵-۵- حجم.۱۵
۱-۵-۶- غلظت.۱۶
۱-۶- انواع مرگ سلولی و تعریف آن.۱۸
۱-۶-۱- نکروز۱۸
۱-۶-۲- آپوپتوز سلولی۱۸
۱-۶-۲-۱ مراحل آپوپتوز ۱۹
۱-۶-۲-۲ مسیر های آپوپتوز۲۱
۱-۶-۲-۳- عناصر کلیدی مسیرهای آپوپتوز.۲۱
۱-۶-۲-۴- روش های بررسی آپوپتوز .۲۳
۱-۶-۲-۴-۱-  بررسی تغییرات غشاء پلاسمایی در مرگ سول .۲۳
۱-۶-۲-۴-۱-۱- تعیین فسفاتیدیل سرین سطح بیرونی غشاء سلول۲۴
۱-۶-۲-۴-۲-  بررسی سیتوتوکسیسیتی ۲۴
۱-۶-۲-۴-۳-  بررسی تغییرات مورفولوژی ۲۵
۱-۶-۲-۴-۳-۱-  استفاده از میکروسکوپ الکترونی۲۵
۱-۶-۲-۴-۳-۲-  استفاده از میکروسکوپ نوری وفلورسانس۲۵
۱-۷-  منشاء آسیب DNA اسپرم۲۶
۱-۷-۱-  بسته بندی غیرطبیعی کروماتین.۲۷
۱-۸-  ساختار کروماتین اسپرم و تأثیر آن بر ناباروری ۲۸
۱-۸-۱-  بررسی ساختار کروماتین اسپرم.۲۸
۱-۹-  نقش آپوپتوز در آسیب DNA اسپرم.۲۹
۱-۱۰-  استرس اکسیداتیو به واسطه ROS30
۱-۱۱-  تاثیر عوامل محیطی برسلامت DNA  و میزان موفقیت روش های کمک باروری.۳۱
۱-۱۱-۱-  مصرف سیگار.۳۱
۱-۱۱-۲-  مواجهات شغلی.۳۲
۱-۱۱-۳-  داروهای شیمی درمانی و رادیوتراپی۳۳
۱-۱۱-۴-  سن.۳۳
۱-۱۲-  تکنیک­های بررسی ساختار کروماتین۳۳
۱-۱۲-۱-  روش­های تعیین آسیب DNA اسپرم انسان.۳۴
۱-۱۲-۱-۱- تست TUNEL.35
۱-۱۲-۱-۲- روش DBD-FISH.35
۱-۱۲-۱-۳- روش Comet.36
۱-۱۲-۱-۴- رنگ­آمیزی CMA336
۱-۱۲-۱-۵- تکنیک SCSA37
۱-۱۲-۱-۶- تست  SCD37

۱-۱۲-۱-۷- رنگ­آمیزی آکریدین اورانژ۳۹

۱-۱۲-۱-۸- رنگ­­آمیزی تولوئیدین بلو۳۹
۱-۱۳- روش مهاجرت اسپرم۳۹
۱-۱۴- روش سانتریفیوژ شیب غلظت.۴۰
فصل دوم- مواد و روش ها.۴۱
۲-۱- مواد و وسایل  مورد نیاز.۴۲
۲-۱-۱- وسایل مورد نیاز.۴۲
۲-۱-۲- مواد مورد نیاز.۴۲
۲-۲- ساخت محلول های مورد نیاز۴۵
۲-۲-۱- ساخت محلول Ham’s F10.45
۲-۲-۲- محلول های لازم برای تست پراکندگی کروماتین اسپرم (SCD)46
۲-۲-۳- ساخت محلول تانل۴۶
۲-۲-۴- ساخت محلول (PBS).46
۲-۲-۵- ساخت رنگ ائوزین-نیگروزین.۴۷
۲-۲-۶- ساخت رنگ رایت.۴۷
۲-۳- روشها۴۸
۲-۳-۱- روش جمع آوری اسپرم. ۴۸
۲-۳-۲- آنالیز مایع انزالی ۴۸
۲-۳-۲-۱- آزمایشات ماکروسکوپی۴۸
۲-۳-۲-۱-۱-  ظاهر۴۸
۲-۳-۲-۱-۲- آبکی کردن۴۸
۲-۳-۲-۱-۳-  حجم۴۸
۲-۳-۲-۱-۴-  چسبندگی۴۸
۲-۳-۲-۲- آزمایشات میکروسکوپی.۴۹
۲-۳-۲-۲-۱- آگلوتیناسیون۵۰
۲-۳-۲-۲-۲- بررسی تعداد اسپرم۵۰
۲-۳-۲-۲-۲-۱- روش استفاده از MAKLER CHAMBER برای شمارش .۵۰
۲-۳-۲-۲-۳- ارزیابی تحرک۵۱
۲-۳-۲-۲-۳-۱- روش کار۵۲
۲-۳-۲-۲-۴- ارزیابی قابلیت حیات۵۳
۲-۳-۲-۲-۴-۱- روش کار رنگ آمیزی ائوزین-نیگروزین.۵۳
۲-۳-۲-۲-۵- ارزیابی مورفولوژی۵۴
۲-۳-۲-۲-۵-۱- رنگ آمیزی پاپانیکولا۵۴
۲-۳-۲-۲-۵-۲- روش فیکس کردن.۵۴
۲-۳-۲-۲-۵-۳-روش رنگ آمیزی پاپانیکولا.۵۵
۲-۳-۳-  Direct swim-up.57
۲-۳-۳-۱- روش کار۵۷
۲-۳-۴- تست بررسی میزان پراکندگی کروماتین اسپرم (SCD).58
۲-۳-۴-۱- روش کار.۵۸
۲-۳-۵- روش رنگ آمیزی تانل.۶۰
۲-۳-۶- آنالیز آماری۶۲
فصل سوم- نتایج.۶۳
۳-۱ نتایج اثر آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up  برروی تحرک اسپرم۶۴
۳-۲- نتایج اثر آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up  برروی قابلیت حیات اسپرم۶۷
۳-۳- نتایج اثر آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up  برروی مورفولوژی اسپرم۶۸
۳-۴- نتایج اثر آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up  برروی قطعه قطعه شدن DNA اسپرم.۷۰
۳-۵- نتایج اثر زمان های مختلف انکوباسیون(۳،۲،۱،۰ساعت) بعد از  آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up  برروی قطعه قطعه شدن DNA اسپرم۷۲
۳-۶- نتایج اثر زمان های مختلف انکوباسیون(۳،۲،۱،۰ساعت) بعد از  آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up  برروی آپوپتوز اسپرم۷۵
۳-۷- رابطه میزان قطعه قطعه شدن DNA اسپرم با سایر پارامترهای اسپرم۷۸
۳-۸- رابطه میزان آپوپتوز اسپرم با سایر پارامترهای اسپرم.۷۹
۳-۹- رابطه میزان قطعه قطعه شدن DNA اسپرم با میزان آپوپتوز اسپرم۸۰
۳-۱۰- نتایج کلی۸۰
فصل چهارم- بحث۸۱
۴-۱- تا ثیر روش آماده سازی Dricct Swim up بر روی پارامترهای اسپرم.۸۳
۴-۲- تاثیر زمان های مختلف انکوباسیون اسپرم در دمای ۳۷ درجه سانتی گراد بر روی قطعه قطعه شدن DNA و آپوپتوز اسپرم.۸۴
۴-۳- پیشنهادات.۹۰
منابع
چکیده انگلیسی

فهرست شکل ها
عنوان                                                                                                          صحنه
۱-۱- ساختار اسپرم انسانی۹
۱-۲- ارزیابی آسیب DNA توسط: .A.TUNEL, B.COMET, C.CMA337
۱-۳- تست  SCD38
۲-۱- انواع مختلف آگلوتیناسیون۵۰
۲-۲- MAKLER CHAMBERبرای شمارش اسپرم استفاده می شود۵۱
۲ -۳- شکل لامل MAKLER CHAMBER .52
۲-۴- چگونگی قرارگیری لوله فالکون بازاویه ۴۵ درجه در انکوباتور.۵۷
۳-۱- رنگ آمیزی ائوزین-نیگروزین برای سنجش میزان زنده یا مرده بودن اسپرم۶۷
۳-۲- رنگ آمیزی پاپانیکولا ۶۹
۳-۳- تست SCD برای بررسی میزان قطعه قطعه شدن DNA اسپرم میباشد۷۴
۳-۴- رنگ آمیزی TUNEL76

فهرست جدول ها
عنوان                                                                                                   صفحه
۱-۱ : خصوصیات میکرسکوپی نمونه انزال طبیعی مطابق با استاندارد های سازمان بهداشت جهانی (۲۰۱۰/WHO).17
۲-۱- ساخت Ham’sf1045
۲-۲- محلول های لازم برای رنگ آمیزی پاپانیکولا۵۵
۳-۱-مقایسه پارامترهای اسپرمی قبل و بعد از آماده سازی اسپرم ۷۱
۳-۲-مقایسه میانگین اثر زمان های مختلف انکوباسیون(۳،۲،۱،۰ساعت) بعد از  آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up  برروی قطعه قطعه شدن DNA آپوپتوز اسپرم۷۷
۳-۳-مقایسه مقدار P اثر زمان های مختلف انکوباسیون(۳،۲،۱،۰ساعت) بعد از  آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up  برروی قطعه قطعه شدن DNA و آپوپتوز اسپرم.۷۷
۳-۴- رابطه میزان قطعه قطعه شدن DNA اسپرم با سایر پارامترهای اسپرم۷۸
۳-۵- رابطه میزان آپوپتوز اسپرم با سایر پارامترهای اسپرم۷۹

فهرست نمودارها
عنوان                                                                                                  صفحه
۳-۱- مقایسه میانگین حرکت پیشرونده، حرکت سریع و حرکت کند قبل و بعد از آماده سازی اسپرم به روش Swim-up.66
۳-۲- مقایسه میانگین قابلیت حیات و مورفولوژی اسپرم قبل و بعد از آماده سازی به روش  Swim-up68
۳-۳- مقایسه میانگین حرکت پیشرونده و قطعه قطعه شدن DNA اسپرم قبل و بعد از آماده سازی به روش   Swim-up70
۳-۴- مقایسه میانگین قطعه قطعه شدن DNA  اسپرم در زمان های مختلف انکوباسیون بعد از آماده سازی به روش  Swim-up.73
۳-۵- مقایسه میانگین آپوپتوز  اسپرم در زمان های مختلف انکوباسیون بعد از آماده سازی به روش  Swim-up.76
تعداد صفحه : ۱۲۴
قیمت : ۱۴۷۰۰ تومان

بلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد

و در ضمن فایل خریداری شده به ایمیل شما ارسال می شود.

پشتیبانی سایت :        ****       [email protected]

در صورتی که مشکلی با پرداخت آنلاین دارید می توانید مبلغ مورد نظر برای هر فایل را کارت به کارت کرده و فایل درخواستی و اطلاعات واریز را به ایمیل ما ارسال کنید تا فایل را از طریق ایمیل دریافت کنید.

***  **** ***