Get a site

پایان نامه :کلونینگ و بیان فاکتور محرک رشد کلنی گرانولوسیتی(GCSF) نوترکیب در مخمر Hansenula Polymorpha

 

پایان‌نامه

جهت دریافت درجه کارشناسی ارشد در رشته زیست‌شناسی ژنتیک (آزاد)

 

عنوان:

کلونینگ و بیان فاکتور محرک رشد کلنی گرانولوسیتی(GCSF) نوترکیب در مخمر Hansenula Polymorpha

استاد راهنما:

دکتر یگانه طالب خان گروسی

 

استاد مشاور:

دکتر رضا نظام زاده

پاییز ۱۳۹۳

 

فهرست مطالب

عنوان                                                                                                            صفحه
فصل اول مقدمه
میکروبیولوژی هانسونلا پلی مورفا.۱
مطالعات ژنتیکی.۲
جهش در ژنهای کد کننده آنزیم های پراکسی زومی یا سیتوپلاسمی درگیر در متابولیسم متانول۴
نقشه ژنتیکی.۵
تولید مثل واسپورزایی.۶
اسپورزایی۶
پروموتورهای مورد استفاده در سیستم بیانی هانسونلا پلی مورفا RB11.7
HARS18
بیان همزمان۹
ترشح پروتئین های هترولوگ الیگومری و فعال۱۰
تولید واکسن نوترکیب۱۰
مخمرها به عنوان میکروارگانیسم های تولیدی.۱۱
ساخت سویه هانسونلا پلی مورفا بیان کننده آنتی ژن HBS.11
تولید کاست بیانی و وکتور پلاسمیدی۱۱
انتقال وکتورهای بیانی به هانسونلا پلی مورفا۱۲
جداسازی سویه های نوترکیب۱۲
تنظیم متابولیسم متانول۱۲
فاکتور محرک رشد کلنی (G-CSF).13
ژن gcsf.13
پروتئین GCSF13
عملکرد پروتئین GCSF.14

فصل دوم مواد و روش ها
میکروارگانیسم های مورد استفاده.۱۷
محیط های کشت مورد نیاز۱۷
پلاسمیدهای مورد استفاده.۱۸
آنزیم ها و کیت ها.۱۸
آنتی بیوتیک ها.۱۸
الکتروفورز افقی محصول PCR و یا نمونه DNA بر روی ژل آگارز.۱۹
تخلیص محصول هضم آنزیمی با بهره گرفتن از کیت تخلیص از ژل آگارز۱۹
واکنش لیگاسیون قطعات تخلیص شده.۲۰
تهیه سلول های مستعد ‘E. coli TOP10F به روش تیمار با کلرید کلسیم.۲۰
انتقال پلاسمید به سلول های مستعد۲۱
بررسی کلونهای نوترکیب به روش سریع۲۱
PCR بر روی کلنی های باکتریایی/مخمری۲۲
استخراج پلاسمید در مقیاس کم.۲۲
استخراج پلاسمید در مقیاس زیاد.۲۳
الکتروفورز پروتئین بر روی ژل پلی اکریل آمید(SDS-PAGE)24
سنتز ژن gcsf.29
PCR اختصاصی بر روی ژن gcsf30
کلون نمودن ژن gcsf در وکتور بیانی هانسونلا.۳۱
هضم آنزیمی وکتور pGH-gcsf.32
هضم آنزیمی وکتوربیانی  pHan33
کلون نمودن قطعه gcsf در وکتور بیانی pHan.33
بررسی کلون های نوترکیب pHan-gcsf.34
هضم آنزیمی وکتور pHan-gcsf35
کلون نمودن ژن مقاومت به زئوسین در وکتور بیانی pHan-gcsf.35
PCR اختصاصی بر روی ژن مقاومت به زئوسین۳۵
کلون نمودن ژن zeocin در وکتور کلونینگ pGEM-T Easy37
بررسی کلون های نوترکیب pGEM-zeo.38
کلون نمودن ژن مقاومت به زئوسین در وکتور بیانی pHan-gcsf39
هضم آنزیمی وکتور pHan-gcsf و pGEM-zeo39
کلون نمودن ژن مقاومت به زئوسین در وکتور بیانی تیمار شده با آلکالین فسفاتاز pHan-gcsf.40
بررسی کلونهای نوترکیب pHan-gcsf-zeocin.41
انتقال پلاسمید نوترکیب pHan-gcsf-zeocin به سلول هانسونلا پلی مورفا.۴۱
هضم آنزیمی وکتور بیانی pHan-gcsf-zeocin.41
الکتروپوریشن سلول های هانسونلا پلی مورفا.۴۲
تأیید کلونهای نوترکیب هانسونلا با روش Colony PCR اختصاصی ژن زئوسین.۴۳
بیان پروتئینGCSF  در هانسونلا پلی مورفا۴۴
کشت سلولهای مخمری۴۴
بررسی بیان پروتئین نوترکیب با روش SDS-PAGE44
تزریق نمونه پروتئینی به خرگوش.۴۵
ایمونوبلاتینگ.۴۶

فصل سوم نتایج
سنتز ژن gcsf.49
PCR  اختصاصی بر روی ژن gcsf.49
طراحی پرایمر های اختصاصی ژن gcsf.49
بهینه سازی واکنش PCR برای ژن gcsf.50
کلون نمودن ژن gcsf در وکتور بیانی هانسونلا.۵۱
هضم آنزیمی وکتور کلونینگ pGH-gcsf و وکتور بیانی pHan.51
بررسی کلونهای نوترکیب pHan-gcsf.52
بررسی کلونها به روش سریع.۵۲
انجام PCR ژن gcsf بر روی پلاسمید نوترکیب pHan-gcsf52
هضم آنزیمی وکتور تأیید شده pHan-gcsf53
کلون نمودن ژن مقاومت به زئوسین در وکتور بیانی pHan-gcsf.54
PCR  اختصاصی بر روی ژن مقاومت به زئوسین (Sh ble).54
کلون نمودن ژن zeocin در وکتور کلونینگ pGEM-T Easy55
تأیید کلون های نوترکیب pGEM-zeocin.55
بررسی سریع کلونهای نوترکیب۵۵
هضم آنزیمی پلاسمید نوترکیب pGEM-zeo با BglII.56
کلون نمودن ژن مقاومت به زئوسین در وکتور بیانی pHan-gcsf57
بررسی کلونهای نوترکیب pHan-gcsf-zeocin57
بررسی سریع کلونهای نوترکیب۵۷
بررسی کلونها به روش Colony-PCR.58
برش آنزیمی وکتور نوترکیب pHan-gcsf-zeo.58
انتقال پلاسمید نوترکیب pHan-gcsf-zeocin به سلول هانسونلا پلی مورفا.۵۹
هضم آنزیمی وکتور بیانی pHan-gcsf-zeocin و انتقال به سلول هانسونلا۵۹
تأیید کلونهای نوترکیب هانسونلا با روش Colony-PCR ژن زئوسین۵۹
بیان پروتئینGCSF  در هانسونلا پلی مورفا.۶۰
تأیید پروتئین نوترکیب تولید شده با روش Immuno-Blotting.61
فصل چهارم :بحث و پیشنهادات
رویکرد کلی پژوهش۶۳
فصل پنجم : منابع و پیوست
فهرست منابع و مواخذ۶۶
پیوست‌ها۷۵
 

مقدمه

تولید پروتئین های نوترکیب یک بازار میلیارد دلاری دارا می باشد. از طرف دیگر تولید یک محصول نوترکیب جدید با انتخاب یک میزبان مناسب شروع می شود. در میان سیستم های بیانی مختلف، سلولهای مخمری به عنوان تک سلولی های تولید کننده  با ویژگی دستکاری های ژنتیکی ساده و داشتن مسیرهای ترشحی اختصاصی که در تولید پروتئین کامل و فعال و انتقال آن به خارج از سلول مؤثر می باشند، یکی از بهترین انواع سیستم های شناخته شده می باشند. ساکارومیسس سرویزیه، پیکیا پاستوریس و هانسونلا پلی مورفا در اکثر مطالعات به عنوان سلولهای مخمری میزبانی مورد استفاده قرار گرفته اند که دارای مسیر مشترک بیوشیمیایی در متابولیسم متانول می باشند. در حال حاضر تکنولوژی هانسونلا به دلیل میزان بیان بالا مورد توجه جهانی قرار گرفته است. از جمله اقلام دارویی تولید شده در این سلولها میتوان به واکسن هپاتیت B، انسولین و اینترفرون آلفا و بتا اشاره نمود.
هدف از این مطالعه ، استفاده از وکتور بیانی طراحی شده جهت بیان فاکتور رشد کلنی گرانولوسیتی (GCSF) نوترکیب به عنوان پروتئین کاندید می باشد.
مواد و روش ها
cDNA کد کننده ژن فاکتور محرک رشد کلونی گرانولوسیتی در وکتور بیانی طراحی شده  مربوط به هانسونلا پلی مورفا  که شامل پروموتر، توالی سیگنال پپتید، توالی خاتمه دهنده رونویسی و شاخص انتخابی اوکسوتروفی می باشد کلون گردید و بدین ترتیب وکتور بیانی مورد نظر ساخته شد. هضم های آنزیمی به منظور تأیید قطعات کلون شده در وکتور بیانی طراحی شده انجام شد. القاء بیان پروتئین نوترکیب در این سیستم با متانول صورت گرفت و ایمونوبلاتینگ جهت تأیید پروتئین تولید شده نوترکیب صورت گرفت.
نتایج
ماهیت توالیهای کلون شده در وکتور بیانی از طریق هضم های آنزیمی با بهره گرفتن از سایتهای طراحی شده در توالی سنتز شده و مشاهده قطعات مورد نظر در ژل آگارز ارزیابی شد. وکتور نوترکیب به فرم خطی با روش الکتروپوریشن به سلول مستعد هانسونلا پلی مورفا انتقال داده شد و القاء بیان پروتئین با متانول صورت پذیرفت. پروتئینی حدوداً ۲۰ کیلو دالتونی بر روی ژل SDS-PAGE مشاهده گردید که با ایمونوبلاتینگ پروتئین تولید شده به عنوان GCSF تأیید شد.
بحث
پروتئین تولید شده با روش بلاتینگ تأیید گردید. در ادامه بایستی عملکرد این پروتئین در واکنشهای ایمونولوژیکی مورد بررسی قرار گیرد. از طرف دیگر عملکرد این پروتئین در مقایسه با فرم تولید شده در E. coli مقایسه شود.
کلید واژه ها
هانسونلا پلی مورفا، فاکتور محرک رشد کلونی گرانولوسیتی (GCSF)، مهندسی ژنتیک

فصل اول : مقدمه

در طول چند دهه اخیر به سه دلیل زیر مطالعات زیادی بر روی مخمر هانسونلا پلی مورفا صورت گرفته است:

  1. رشد سریع این مخمر با مصرف متانول به عنوان تنها منبع کربن و انرژی،
  2. تحمل دماهای بالا (توانایی رشد در دمای °C49)،
  3. تبادل آسان محتوای ژنتیکی بین سلولهای هاپلوئید و دیپلوئید ( (Teunisson, 1960.

۱-۱میکروبیولوژی هانسونلا
این مخمر برای اولین بار در سال ۱۹۵۱ از آب پرتقال حاوی ۵۰% قند در فلوریدای آمریکا جداسازی شد.
سلولهای هانسونلا به هر دو صورت سلولهای دیپلوئیدی و هاپلوئیدی رشد می کنند. کلنی ها بر روی محیط کشت جامد دارای طیف رنگی صورتی هستند که به علت آسکوسپورها می باشد. کلنی سلولهای هاپلوئیدی و دیپلوئیدی از نظر رنگ، اندازه، چیدمان سلولی و سایر ویژگیها با یکدیگر متفاوت می باشند.
تاکنون اطلاعاتی در مورد توانایی هانسونلا پلی مورفا در تشکیل میسلیوم کاذب پیدا نشده است (Teunisson, 1960; Wickerham, 1970).
شکل ۱-۱ مخمر H. polymorpha
هانسونلا پلی مورفا میتواند در دمای بالا و در °C42 رشد کند. به نظر می رسد در این مخمر سنتز تره هالوز قسمتی از پاسخ به قحطی منبع کربن و شوک حرارتی است و پیشنهاد شده که این ترکیب، فاکتور مهمی در مقاومت دمایی است (Reinders, 1999).
مطالعات انجام شده بر روی هانسونلا پلی مورفا به طور عمده به بررسی پروتئین های سلولی، ساختار سلولهای مخمر در حال رشد و یا بررسی متابولیسم مخمر پرداخته اند.
در سویه هایی از این مخمر که از متانول به عنوان منبع انرژی استفاده می کنند، آنزیمهای متانول اکسیداز و کاتالاز، به فرم کریستالی درون اندامکی به نام پراکسی زوم قرار گرفته اند (Van Dijken, 1975).
هانسونلا پلی مورفا بعنوان یک ارگانیسم متیلوتروف، یک مدل مطلوب برای تحقیق در مورد عملکرد پراکسی زم ها و تکامل حیات می باشد. همچنین به منظور بررسی ژنتیکی جنبه های مختلف متابولیسم سلولی از جمله متابولیسم متانول، جذب نیترات و مقاومت به فلزات سنگین مورد مطالعه قرار می گیرد ( (Mannazzu, 2000.
با وجود این ویژگیها، هنوز قابلیت های ژنتیکی و طبیعی سویه های مورد استفاده از این مخمر کاملاً مشخص نیست و کنترل ژنتیکی فرایندهای سلولی پایه از جمله کنترل تقسیم سلولی، تولید مثل و اسپورزایی هنوز با سؤالات زیادی مواجه می باشد.
با اینحال هانسونلا پلی مورفا به عنوان یک میزبان برای تولید پروتئین های خارجی(ترشحی به خارج از سلول) توجه زیادی را به خود جلب کرده است ( (Gellissen, 2000.
تعداد صفحه : ۱۰۳
قیمت : ۱۴۷۰۰ تومان

بلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد

و در ضمن فایل خریداری شده به ایمیل شما ارسال می شود.

پشتیبانی سایت :        ****       [email protected]

در صورتی که مشکلی با پرداخت آنلاین دارید می توانید مبلغ مورد نظر برای هر فایل را کارت به کارت کرده و فایل درخواستی و اطلاعات واریز را به ایمیل ما ارسال کنید تا فایل را از طریق ایمیل دریافت کنید.

***  *** ***