Get a site

برچسب: نعناع فلفلی

پایان نامه جداسازی و شناسائی اندوفیت­های گیاهان داروئی بابونه نعناع فلفلی

پایان نامه رشته  زیست شناسی گرایش: میکروب شناسی

دانشگاه آزاد اسلامی

واحد دامغان

دانشکده علوم پایه

پایان نامه برای دریافت درجه کارشناسی ارشد «M.Sc»

رشته: زیست شناسی

گرایش: میکروب شناسی

عنوان:

جداسازی و شناسائی اندوفیت­های گیاهان داروئی بابونه نعناع فلفلی مارچوبه بومی استان گلستان و تاثیر آنها در گیاهان

استاد راهنما:

دکتر محمد حسین ارزانش

استاد مشاور:

دکتر رضا نظام زاده

تکه هایی از متن به عنوان نمونه :

 

عنوان صفحه
چکیده ۱
مقدمه ۲
اهمیت و ضرورت تحقیق ۳
اهداف تحقیق ۳
فصل اول- کلیات
۱-۱-اندوفیت ۴
۱-۱-۱- مقدمه ۴
۱-۱-۲- اکولوژی باکتری های اندوفیت ۵
۱-۲-۳- منشاء باکتری های اندوفیت ۵
۱-۱-۴- نحوه ی ورود باکتری های اندوفیت به درون بافت های گیاهی. ۸
۱-۱-۵- حرکت باکتری های اندوفیت در بافت های گیاهی. ۱۰
۱-۱-۶ – محل استقرار باکتری های اندوفیت ۱۱
۱-۱-۷ – تراکم جمعیت باکتری های اندوفیت ۱۲
۱-۱-۷-۱- فاکتورهای زنده ۱۳
۱-۱-۷-۱-۱- میکروارگانیسم های همراه با گیاه ۱۳
۱-۱-۷-۱-۱-۱- باکتری ها و قارچ ها ۱۳
۱-۱-۷-۱-۱-۲- ویروس ها. ۱۳
۱-۱-۷-۱-۱-۳- نماتد ها. ۱۳
۱-۱-۷-۱-۲- ژنوتیپ گیاه. ۱۴
۱-۱-۷-۲- فاکتورهای غیر زنده ۱۴
۱-۱-۸- اثرات مفید باکتری های اندوفیت گیاهی. ۱۵
۱-۱-۸-۱- افزایش رشد گیاه ۱۵
۱-۱-۸-۲- کنترل بیولوژیکی بیمارگرهای گیاهی ۱۷
۱-۱-۸-۳- استفاده ازاندوفیت ها در مهندسی ژنتیک ۱۷
۱-۱-۸-۴- افزایش تولید مواد دارویی توسط گیاه ۱۷
۱-۱-۹- نحوه ی استفاده از باکتری های اندوفیت ۱۸
۱-۲- نعناع فلفلی ۱۸
۱-۲-۱- ترکیبات. ۱۹
۱-۲-۲- خاستگاه و پراکنش ۱۹
۱-۲-۳- استفاده های دارویی ۱۹
۱-۳- مارچوبه. ۱۹
۱-۳-۱- خاستگاه و پراکنش ۲۰
۱-۳-۲- استفاده های دارویی ۲۰
۱-۴- بابونه. ۲۰
۱-۴-۱- ترکیبات شیمیایی ۲۰
۱-۴-۲- خواص دارویی و درمانی ۲۰
۱-۵- باسیلوس ۲۱
۱-۵-۱- مقدمه ۲۱
۱-۵-۲- باسیلوس های خاک و ویژگی آنها ۲۴
۱-۵-۳- رنگ آمیزی گرم برای تشخیص باسیلوس ها ۲۴
۱-۶- قارچ ها ۲۴
۱-۶-۱- معرفی کلی ماهیت قارچ ها ۲۴
۱-۶-۲- اهمیت بالینی قارچ ها. ۲۵
۱-۶-۳- بیماری زایی قارچ ها. ۲۶
۱-۶-۳-۱- کنترل بیماری های قارچی ۲۶
۱-۶-۴- معرفی قارچ های مورد آزمایش ۲۶
۱-۶-۴-۱- آسپرژیلوس های بیماری زا ۲۶
۱-۶-۴-۲- فوزاریوم. ۲۷
۱-۶-۴-۳- آلترناریا. ۲۷
۱-۶-۴-۴- موکور. ۲۸
فصل دوم : مروری برمطالعات گذشته
فصل سوم : مواد و روش ها
۳-۱- تجهیزات و دستگاه ها ۳۳
۳-۲- انواع و ترکیبات محیط کشت های مورد استفاده. ۳۴
۳-۳- نوع مطالعه و روش نمونه گیری ۳۴
۳-۴- وسایل نمونه یری. ۳۴
۳-۵- وسایل آزمایشگاهی ۳۴
۳-۶- انتخاب محیط کشت غربالگری ۳۴
۳-۷- جداسازی باکتری های اندوفیت از ریشه گیاهان دارویی. ۳۵
۳-۷-۱- خالص سازی کشت های باکتریایی. ۳۵
۳-۸- شناسایی مقدماتی جنس و گونه ی جدایه های باکتریایی ۳۴
۳-۸-۱- بررسی توانایی رشد در غلظت های مختلف Nacl ۳۶
۳-۸-۲- بررسی فعالیت آنزیمی. ۳۶
۳-۸-۲-۱- فعالیت اوره آزی. ۳۶
۳-۸-۳- بررسی فعالیت تجزیه ای. ۳۶
۳-۸-۳-۱- تجزیه نشاسته. ۳۶
۳-۹- شناسایی تکمیلی(شناسایی مولکولی با روش ریبوتایپینگ) ۳۷
۳-۹-۱- شرایط PCR ۳۸
۳-۹-۲- تعیین توالی DNA. ۳۹
۳-۱۰- آزمون بازدارندگی رشد عوامل بیماری زای گیاهی ۳۹
۳-۱۰-۱- تهیه سوسپانسیون باکتری ها. ۳۹
۳-۱۱- اثر تلقیح باکتری های اندوفیت روی پارامتر رویشی گیاه ۴۰
۳-۱۱-۱- مرحله کاشت ۴۰
۳-۱۱-۲- مرحله داشت و تنک کردن. ۴۱
۳-۱۲- اندازه گیری طولی گیاه ۴۱
فصل چهارم : نتایج
۴-۱- جداسازی باکتری های اندوفیت از ریشه گیاهان دارویی. ۴۲
۴-۲- نتایج تست های بیو شیمیایی. ۴۴
۴-۳- تعیین توالی محصولات نهایی PCR. ۴۵
۴-۳-۱- نتایج حاصل از سکوئنسینگ ژن ۱۶ s rDNA باکتری ۴۵
۴-۴- نتایج آنتاگونیسمی بدست آمده از سویه های باسیلوس علیه قارچ های مورد آزمایش ۵۸
۴-۴-۱- نتایج اثر ضد قارچی علیه آسپرژیلوس نایجر ۵۹
۴-۴-۲- نتایج اثر ضد قارچی علیه فوزاریوم اکسیپوروم. ۶۰
۴-۴-۳- نتایج اثر ضد فارچی علیه آلترناریا آلترناتا. ۶۲
۴-۴-۴- نتایج اثر ضد قارچی علیه موکور. ۶۳
۴-۵- نتایج اندازه گیری رشد طولی گیاه. ۶۵
۴-۵-۱- نتایج اندازه گیری رشد طولی در گیاه مارچوبه. ۶۶
۴-۵-۲- نتایج اندازه گیری رشد طولی در گیاه نعناع فلفلی ۶۷
منابع. ۷۲

چکیده

اندوفیت ها میکروارگانیسم هایی اند که حداقل بخشی از زندگی خود را در گیاه به سر می برند. آنها از گیاه سود می برند و از مواد مغذی گیاه استفاده می کند و گیاه نیز به نوبه ی خود با کاهش استرس وافزایش رشد از این تعامل سود می برد. در گذشته تصور می شد که باکتری های اندوفیت باعث بیماری زایی خفیفی در گیاهان می شوند اما تحقیقات اخیر ثابت نمود که این دسته از باکتری ها قادر هستند رشد گیاه را بهبود بخشیده و سبب افزایش مقاومت علیه بیمارگرهای گیاهی شوند. در این مطالعه به جداسازی اندوفیت های سه گیاه داروئی به نام های نعناع فلفلی، بابونه و مارچوبه پرداخته شد که نمونه گیاهان از سه منطقه استان گلستان جمع آوری شد. نتایج حاصل از شناسایی، سویه های جدا شده را در جنس باسیلوس قرار داد. شش باکتری اندوفیت (هر گیاه دو اندوفیت) جداشد. اندوفیت های جدا شده از نظر پتانسیل ضد قارچی علیه چهار قارچ بنام فوزاریوم اکسی پوروم، آسپرژیلوس نایجر، آلترناریا آلترناتا و موکور مورد مطالعه قرار گرفتندکه همگی آنها اثر ضد قارچی نشان دادند. در بین آنها اندوفیت های موجود در نعناع فلفلی بیشترین اثرضد قارچی را روی عوامل بیماری زای گیاهی نشان داد. همین طور اثر آنها در رشد گیاه نیز بررسی شد که آزمایشات نتایج قابل قبولی از اثرمثبت آنها در رشد گیاه را نشان داد.

کلمات کلیدی: گیاهان دارویی، اندوفیت، آنتاگونیسمی، باسیلوس

مقدمه

حضور و استقرار باکتری های غیر بیماری زا در بافت های گیاهی به سال ۱۹۲۶ و به تئوری پروتی[۱] بر می گردد. بعد از سال ۱۹۴۰ تاکنون گزارشات زیادی در ارتباط با باکتری های اندوفیت بومی در بافت های مختلف گیاهی وجود دارد(هالمن و همکاران ۱۹۹۷)[۲].

در گذشته تصور می شد که باکتری های اندوفیت باعث بیماری زایی خفیفی در گیاهان می شوند اما تحقیقات اخیر ثابت نمود که این دسته از باکتری ها قادرهستند رشد گیاه را بهبود بخشیده و سبب افزایش مقاومت علیه بیمارگرهای گیاهی شوند(هالمن و همکاران ۱۹۹۷).

از نظر تکاملی به نظر می رسد که باکتری های اندوفیت حد واسط باکتری های ساپروفیت و باکتری های بیمارگر گیاهی بوده و آنها ساپروفیت هایی اند که توانسته اند خود را در پناهگاهی حفظ نمایند و بدون اینکه میزبان خود را از بین ببرند از مواد موجود در گیاه برای رشد و تکثیر خود استفاده نمایند. فسیل ها ارتباط بین گیاهان و اندوفیت ها را نشان می دهند، در نتیجه اندوفیت ها نقش مهم و دراز مدتی را در تکامل حیات بر روی زمین بر عهده داشتند.

(هالمن و همکاران ۱۹۹۷).

اندوفیت ها درون گیاه حضور دارند و بیش از ۱۲۰ سال است که شناخته شده اند. بعد ها آنها را به عنوان میکروارگانیسم هایی که می توان آنها را از سطح سترون گیاه جدا نمود شناختند و در علم زراعت نیز این مفهوم بیشتر باکتری هایی را در بر می گیرد که می توانند از سطح سترون بافت جدا شوند و به طور آشکار به گیاه میزبان آسیب نمی رسانند.

اغلب این باکتری ها از خاک منشاء می گیرند و باید ابتدا در گیاه کلنیزه شوند که این کلنیزاسیون عمدتا از طریق ترک، زخم، آسیب ریشه صورت می گیرد که به این مناطق اصطلاحا”نقطه داغ[۳] می گویند.

بعد از کلنیزاسیون و ورود باکتری ها به گیاه به سرعت در فضای بین سلولی در ریشه گسترش یافته و سپس سیستم های ژنتیک اختصاصی بین باکتری و گیاه فعال می شود.

اندوفیت ها در گیاه از فرآیندهای سلولی استفاده کرده و از طریق قشر مغز به سایر بافت ها گسترش می یابند که در این فرآیند آنزیم هایی نظیر اندوگلوکانامیس و اندوپلی گالاکتورونیداس را می توان نام برد در این زمان اندوفیت ها می توانند به سرعت در گیاه تکثیر یابند و تعداد خود را افزایش دهند. این باکتری ها قادر به تنظیم سطح اتیلن در گیاه اند و این عمل را ازدو طریق ،شکستن ACC و یا مهار ACC سنتتاز انجام می دهند.

همان طور که جانوران و انسان ها به طور معمول با میکرو ارگانیسم های متنوعی در ارتباط اند و میکروارگانیسم ها در توسعه و تحریک سیستم ایمنی نقش مهمی را ایفا می کنند به طور مشابه باکتری های گیاهی یا اندوفیت ها نیز در تحریک واکنش های دفاعی در گیاه نقش دارند و باعث رشد بهتر گیاه از طریق تثبیت نیتروژن، افزایش مواد معدنی در دسترس، تولید ۲و۳ بوتان دی ال، استوئین که مسئول ارتقاء گیاه اند می شوند.

این باکتری ها با تولید مواد ضد میکروبی مانند ترپونوئید، فلاوونوئید، ایزوفلاوونوئید در گیاه باعث مقاومت گیاه در برابر عامل میکروبی بیماری زا در آن می شوند.

با توجه به موقعیت جغرافیایی استان گلستان باکتری های بیشماری می توان از خاک این منطقه جدا نمود که برخی از آنها به صورت اندوفیت می باشند. با توجه به اینکه در مناطق شمالی بیشتر منطقه قابل کشت می باشد و از طرفی این باکتری ها نقش بسیار مهمی را در رشد گیاه و کنترل عوامل بیماری زا در گیاهان ایفا می کنند کمک بسیار بزرگی می تواند در بخش کشاورزی باشد. البته با توجه به اینکه در ایران کمتر به این مسئله پرداخته شده است پس مطالعه روی این موضوع می تواند بسیار حائز اهمیت باشد.

اهمیت و ضرورت تحقیق

  1. عدم اطلاعات قبلی در زمینه جداسازی و شناسائی باکتری های اندوفیت از گیاهان داروئی در استان
  2. بررسی خاصیت ضد میکروبی جدایه های باکتریایی اندوفیت های جدا شده از گیاهان در برابر پاتوژن های قارچی
  3. بررسی افزایش توان رشدی در گیاهان حاوی اندوفیت ها در مقابل گیاهان فاقد اندوفیت ها و استفاده از آنها به جای کود های شیمیایی

اهداف تحقیق :

  1. اندوفیت های ۳ گیاه داروئی به نام های نعناع فلفلی، مارچوبه و بابونه جداسازی و شناسائی شدند.

۲.اثرات ضد قارچی اندوفیت های جداشده بررسی شدند.

۳.توانائی اندوفیت های جدا شده روی افزایش رشد گیاه بررسی شد.

فصل اول

کلیات

۱-۱- اندوفیت

۱-۱-۱- مقدمه

         حضور و استقرار باکتری های غیربیماری زا در بافت های گیاهی به سال ۱۹۲۶ و به تئوری پروتی[۴] برمی گردد.

بعدازسال ۱۹۴۰ تاکنون گزارشات زیادی درارتباط با باکتری های اندوفیت به عنوان عوامل بیماری زایی خفیف درگیاهان وجود دارد، اما تحقیقات اخیرثابت نمودکه این دسته از باکتری قادرهستند رشد گیاه را بهبود بخشیده وسبب افزایش مقاومت علیه بیمارگرهای گیاهی شوند. باکتری های اندوفیت دراکثر گونه های گیاهی حضور دارند.

از نظر تکاملی باکتری های اندوفیت حد واسط باکتری های ساپروفیت و باکتری های بیمارگر گیاهی بوده و در واقع ساپروفیتی اند که به سمت بیمارگری تکامل یافته اند و در واقع اندوفیت ها از بیمارگرهای گیاهی تکامل یافته تر بوده و توانسته اند خود را در پناهگاهی حفظ نمایند، بدون آنکه میزبان خود را از بین ببرنداز مواد موجود در گیاه برای رشد و تکثیر خوداستفاده می نمایند(هالمن و همکاران ۱۹۹۷).

این میکروارگانیسم هادر قرن نوزدهم شناخته شده اند ولی بررسی قابل توجهی روی آنها صورت نگرفت. اندوفیت ها میکروارگانیسم هایی اند که حداقل یک مرحله از چرخه ی زندگی خود را درون گیاهان سپری می کنند. تعاریف مختلفی برای اندوفیت وجود دارد:

کادو[۵] عنوان می کند که اندوفیت های باکتریایی در بافت های زنده گیاهی ساکن اند، بدون آنکه به گیاه صدمه ای بزنند.

کوئیزیل[۶] عنوان می کند که اندوفیت ها قادراند همزیستی داخلی با گیاه برقرار نموده و یک محیط سودمند اکولوژیکی را به واسطه حضور اندونیت ایجاد کنند که گیاه به واسطه ی آن تنش های محیطی را تحمل نموده یا سبب بهبودافزایش رشد گیاه شوند.

ویلسون[۷] عنوان می کند باکتری های اندوفیت بافت های غیر زنده ی گیاه را مورد تهاجم قرار داده ولی علائمی از بیماری را در گیاه ایجاد نمی کند(هالمن و همکاران ۱۹۹۷).

باکتری های اندوفیت باکتری هایی اند با منشا محیط اطراف ریشه (خاک) که حداقل بخشی از چرخه ی زندگی خود را در گیاه به سر می برند و توانسته اند خود را در پناهگاهی حفظ نمایند بدون آنکه به میزبان خود آسیب بزننداز مواد موجود در گیاه برای رشد و تکثیر خود استفاده می کنند و در تعامل باعث افزایش رشد و تحمل تنش های محیطی برای گیاه می شوند.(پابلو و همکاران ۲۰۰۸)[۸].

۱-۱-۲- اکولوژی باکتری های اندوفیت

اندوفیت بودن یک مزیت اکولوژیکی است که بعضی از باکتری ها قادراند بافت های درونی گیاه را کلنیزه نمایند این در حالی است که تعدادی از باکتری ها قادراند گیاه را فقط به صورت      اپی فیت کلنیزه نمایند.

محیط داخلی گیاه یک محیط حفاظت شده و یکنواختی را برای میکروارگانیسم ها فراهم می کند. عواملی مثل درجه حرارت، اشعه ماوراء بنفش و رقابت های میکروبی از جمله عواملی اند که بقاء طولانی مدت باکتری ها را محدود می سازند. استقرار و بقاء یک جمعیت باکتریایی درون بافت گیاه تحت تاثیر عوامل قرار می گیردکه سلامتی گیاه را نیزتحت تاثیر قرار می دهند(هالمن و همکاران ۱۹۹۷)[۹].

تعامل بین گیاه واندوفیت مستلزم آن است که هر دو بتوانند موانع فیزیکی و شیمیایی را که بر سر راه دارند با موفقیت پشت سر نهند تا این ارتباط شکل گیرد(پابلو و همکاران ۲۰۰۸).

۱-۱-۳- منشاء باکتری های اندوفیت

بیشترین پرسش هایی که در ارتباط با باکتری های اندوفیتی مطرح است این است که منشا باکتری های اندوفیتی از کجاست و چگونه وارد گیاه می شوند؟(هالمن و همکاران ۱۹۹۷)

شروع با این فرض است که اندوفیت ازخاکی که گیاه میزبان در حال رشداست سرچشمه می گیرد و فاکتورهای خاک کلنیزه شدن باکتری در گیاه را مشخص می کند(پابلو و همکاران ۲۰۰۸).

در واقع باکتری های اپی فیت، فیلوسفر و ریزوسفر به عنوان منبع باکتری های اندوفیت ذکر شوند. تبادل جمعیتی بین جمعیت های باکتریایی خارج و داخل گیاه از طریق روزنه ها صورت می گیرد. بنابراین باکتری هایی وجود دارندکه قادراند به هر دوصورت اپی فیت و اندوفیت گیاه را کلنیزه کنند(هالمن و همکاران ۱۹۹۷)[۱۰].

فاکتورهایی نظیر ژنوتیپ گیاه، مرحله رشد، وضعیت فیزیولوژیکی، نوع بافت گیاهی، شرایط محیطی (منظورخاک) وشیوه های کشاورزی اغلب تعیین کننده ی کلنیزاسیون اندوفیت ها و جامعه اندوسفری می باشند. علاوه براین موارد صفات ذاتی باکتریایی نیز در کلنیزاسیون و تنوع اندوفیتی نقش مهمی را بازی می کند.

به عنوان مثال دیده شده که نسبت باکتری هایی که حرکت سوارمینگ دارند واز داخل ریشه ی گیاه گندم جدا شدند پنج برابر بیشتراز تعداد آنها در ریزوسفر خاک بوده و این نشان می دهد که باکتری هایی که حرکت سوارمینگ داشتند با حرکت خود از طریق کموتاکسی جذب ریشه شده و موفق به تشکیل میکروکلنی شدند(پابلو و همکاران ۲۰۰۸)[۱۱].

در مطالعات میکروسکوپ الکترونی بذر برنج مشاهده شد که جمعیت پایینی از باکتری های اندوفیت در محل های حفاظت شده ای در پوشش بذر، پوسته های بذری، بافت های جنینی حضور دارند، باکتری های اندوفیت این مکان ها را از میان شکاف های ریزی که در پوشش های بذر وجود دارد کلنیزه می کنند.

زمان جوانه زنی بذر، باکتری ریشه را کلنیزه نمود و در استیل ریشه بالاترین تمرکز را دارد. در تیمار بذری باباکتری اندوفیت، رادیکال های ریشه که تازه از پوشش بذری خارج شوند کلنیزه می شوند. کلنیزه شدن بافت توسط اندوفیت ها، مهاجرت باکتری ها از میان شکاف های تشکیل شده، در اثر جوانه زنی بذر شروع شده و وارد اندوسپرم می شود وبدین صورت در رادیکال و سایر قسمت های گیاه فراگیر می شود(موخاپودای و همکاران ۱۹۹۶)[۱۲].

ریزوسفرخاک منبع اولیه باکتری های اندوفیت اند. به عبارتی اکثر باکتری های اندوفیت از ریزوسفر منشا گرفته اند و این میکروارگانیسم ها از ریزوسفر به ریزوپلان و سپس به اپیدرم و پوست می آیند.

بنابراین ترکیب جمعیت اندوفیت ها بستگی به ترکیب جمعیتی باکتری های مستقر در ریزوسفر گیاه دارد(استورز ۱۹۹۵).

استورز[۱۳] باکتری های اندوفیت غده های بذری سیب زمینی سالم را شناسائی نمود و نشان داد، گونه هایی که غده های سالم را به صورت داخلی کلنیزه می نمایند از ریزوسفر گیاه منشا گرفتند، به عبارتی غالب ترین گونه های جدا شده از خاک اطراف ریشه همان گونه هایی بودند که از داخل غده ها جدا شدند(کوادت هالمن و همکاران ۱۹۹۷)[۱۴].

تعداد صفحه :۹۱

قیمت : ۱۴۷۰۰ تومان

***

—-

پشتیبانی سایت :        ****       [email protected]

پایان نامه کشاورزی :تولید موتاسیون در گیاه نعناع فلفلی با بهره گرفتن از موتاژن EMS

پایان نامه رشته کشاورزی گرایش بیوتکنولوژی کشاورزی

دانشگاه آزاد اسلامی

واحد دامغان

دانشکده‌کشاورزی

 پایان نامه برای دریافت درجه کارشناسی ارشد

رشته مهندسی کشاورزی (بیوتکنولوژی کشاورزی)

گرایش کشاورزی

عنوان

تولید موتاسیون در گیاه نعناع فلفلی با بهره گرفتن از موتاژن EMS

استاد راهنما

دکترسیدکمال کاظمی‌تبار

استاد مشاور

دکترجعفرمسعودسینکی

تکه هایی از متن به عنوان نمونه :

فهرست مطالب
صفحه عنوان
۱ چکیده.
فصل اول: مقدمه و کلیات
۲ ۱-۱ مقدمه
۳ ۱-۱-۱ اهمیت موضوع.
۴ ۱-۱-۲ فرضیات
۴ ۱-۱-۳ اهداف پژوهش.
۵ ۱-۲ کلیات
۵ ۱-۲-۱ گیاه شناسی.
۶ ۱-۲-۲ نیازهای اکولوژی
۶ ۱-۲-۳ خواستگاه و دامنه انتشار.
۷ ۱-۲-۴ خواص دارویی.
۷ ۱-۲-۵ موارد استفاده
۸ ۱-۲-۶ مواد موثره و اجزاء اسانس
۸ ۱-۲-۷ کشت بافت.
۹ ۱-۲-۷-۱ انواع کشت بافت گیاهی
۱۰ ۱-۲-۷-۲ بررسی اثرات فاکتورهای مختلف در محیط کشت.
۱۰ ۱-۲-۷-۳ نمک‌های غیرآلی
۱۱ ۱-۲-۷-۴ ویتامین‌ها.
۱۱ ۱-۲-۷-۵ منبع انرژی.
۱۱ ۱-۲-۷-۶ میواینوسیتول
۱۲ ۱-۲-۷-۷ عوامل فیزیکی
۱۲ ۱-۲-۷-۸ ریزنمونه.
۱۲ ۱-۲-۷-۹ چگونگی انتخاب محیط کشت
۱۳ ۱-۲-۷-۱۰ ریزازدیادی گیاهان از طریق کشت بافت.
۱۳ ۱-۲-۷-۱۱ریشه‌زائی
۱۴ ۱-۲-۸ تعریف موتاسیون (جهش)
صفحه عنوان
۱۴ ۱-۲-۸-۱ تاریخچه استفاده از موتاسیون
۱۵ ۱-۲-۸-۲ سطوح ایجاد موتاسیون
۱۵ ۱-۲-۸-۳ انواع موتاسیون.
۱۶ ۱-۲-۸-۴ موتاژن (عامل جهش‌زا)
۱۶ ۱-۲-۸-۴-۱ انواع موتاژن
۱۶ ۱-۲-۸-۴-۲ عوامل شیمیایی جهش‌زا
۱۸ ۱-۲-۸-۴-۳ مواد گیاهی مورد تیمار
۱۸ ۱-۲-۸-۴-۴ اصلاح به روش موتاسیون.
۱۹ ۱-۲-۸-۴-۵ اهمیت موتاسیون در اصلاح نباتات. .
۱۹ ۱-۲-۸-۴-۶ موفقیت موتاسیون.
۱۹ ۱-۲-۸-۴-۷ روش‌های جدید استفاده از موتاسیون.
۲۰ ۱-۲-۸-۴-۸ هدف موتاسیون مصنوعی
۲۱ ۱-۲-۹ روغن‌های اسانس.
۲۲ ۱-۲-۹-۱ جداسازی و شناسایی مواد تشکیل دهنده روغن اسانسی گیاه.
          فصل دوم: مروری بر تحقیقات انجام شده
۲۳ ۲-۱ کشت بافت.
۲۴ ۲-۲ اثر موتاژن‌ها در ایجاد تنوع در صفات مختلف
۲۶ ۲-۳ اثر موتاسیون اتیل متیل سولفانات در ایجاد تنوع در سطوح مختلف.
          فصل سوم: مواد و روش‌ها
۳۲ ۳-۱ مواد گیاهی
۳۲ ۳-۲ کشت بافت.
۳۲ ۳-۲-۱ تهیه محلول ذخیره محیط‌های کشت
۳۳ ۳-۲-۱-۱ تهیه محلول ذخیره ماکرو.
۳۴ ۳-۲-۱-۲ تهیه محلول ذخیره عناصر میکرو.
۳۴ ۳-۲-۱-۳ تهیه محلول ذخیره آهن-سدیم
۳۵ ۳-۲-۱-۴ تهیه محلول ذخیره ویتامین
۳۵ ۳-۲-۲ تهیه محیط کشت
صفحه عنوان
۳۶ ۳-۲-۳ ضدعفونی نمونه‌های گیاهی.
۳۶ ۳-۲-۳-۱ ضدعفونی اندام گیاه.
۳۷ ۳-۲-۴ تهیه ریزنمونه
۳۷ ۳-۲-۵ بهینه سازی محیط کشت
۳۷ ۳-۲-۶ بررسی نمونه‌های کشت شده.
۳۸ ۳-۲-۷ تیمارهای مورد استفاده.
۳۸ ۳-۲-۷-۱ روش تهیه استوک EMS .
۳۹ ۳-۲-۷-۲ روش اعمال تیمارهای EMS در گیاه کشت بافتی.
۳۹ ۳-۲-۷-۳ روش اعمال تیمارهای EMS در مزرعه.
۳۹ ۳-۲-۷-۴ روش شستشوی تیمارها
۴۰ ۳-۳ استخراج مواد موثره گیاهی.
۴۰ ۳-۳-۱ روش‌های استخراج اسانس.
۴۰ ۳-۴ آنالیز اجزاء اسانس
۴۱ ۳-۵ آنالیزهای آماری
         فصل چهارم: نتایج و بحث
۴۲ ۴-۱ بررسی نمونه‌های کشت بافتی.
۴۵ ۴-۲ تاثیر EMS برروی خصوصیات مرفولوژیکی گیاه.
۴۶ ۴-۲-۱ اثر دوز EMS و زمان برروی طول ساقه.
۴۷ ۴-۲-۲ اثر دوز EMS و زمان برروی طول ریشه
۴۷ ۴-۲-۳ اثر دوز EMS و زمان برروی تعداد برگ
۴۸ ۴-۲-۴ اثر دوز EMS و زمان برروی تعداد ریشه جانبی
۴۹ ۴-۲-۵ اثر دوز EMS و زمان برروی تعداد جوانه
۵۰ ۴-۲-۶ اثر دوز EMS و زمان برروی متوسط طول برگ.
۵۱ ۴-۲-۷ اثر دوز EMS و زمان برروی تعداد ریشه.
۵۱ ۴-۳ ضریب همبستگی بین صفات و خصوصیات مورد بررسی.
۵۲ ۴-۴ استخراج اسانس
۵۲ ۴-۴-۱ آنالیز و شناسایی کمی و کیفی اجزای موجود در اسانس
صفحه عنوان
۵۳ ۴-۴-۲ نتایج آزمایشگاهی.
۵۳ ۴-۴-۳ نتایج مربوط به طیف کروماتوگرام گازی گیاه
۵۴ ۴-۴-۴ ترکیبات تشکیل دهنده اسانس
         فصل پنجم: نتیجه‌گیری
۵۵ ۵-۱ بحث.
۵۵ ۵-۱-۱ کشت بافت گیاهی
۵۶ ۵-۱-۲ اثرات موتاژن EMS .
۶۰ ۵-۲ نتیجه‌گیری
۶۱ ۵-۳ پیشنهادات.
۶۲ فهرست منابع فارسی.
۶۴ فهرست منابع انگلیسی
۷۱ پیوست‌ها.
۷۵ چکیده انگلیسی.

چکیده
نعناع فلفلی با نام علمی Mentha piperitaیکی از انواع گیاهان دارویی می‌باشد که به دلیل تولید اسانس‌های با ارزش در صنایع داروسازی و بهداشتی استفاده‌های فراوانی دارد. استفاده از مواد موتاسیون‌زا از قبیل EMS می‌تواند تغییرات جهش‌زای نقطه‌ای در گیاه ایجاد کند که در نهایت منجر به ظهور فنوتیپ جدید در این گیاه با ارزش شوید. لذا این پژوهش با انجام تیمارهای متعدد از غلظت‌های مختلف EMS روی سرشاخه‌های رشد یافته در محیط کشت MS بدون هورمون و با غلظت‌های ۰/۰% (به عنوان شاهد)، ۰۵/۰% و ۰۱/۰% و ۰۰۵/۰% از EMS و مدت زمان‌های مختلف (۲۴ و۴۸ ساعت) و همچنین در قسمت مزرعه‌ای نیز از همین غلظت‌ها و زمان‌ها استفاده شد. ارزیابی‌ در داخل لوله آزمایش و مزرعه بطور همزمان انجام گرفت. پس از انتفال و رشد و نمو نمونه‌ها در شرایط in vitro، تیمارها با ماده جهش‌زا اتیل متان سولفانات مورد بررسی قرار گرفتند. فاکتورهای مختلف مورفولوژیکی از قبیل طول ساقه و تعداد ریشه رونده جانبی در سطح ۱% و تعداد برگ و تعداد جوانه در ساقه در سطح ۵% پاسخ معنی‌داری را نشان دادند. نتایج این پژوهش نشان داد که استفاده از مواد جهش‌زا در محیط کشت MS نقش بسزایی در تغییر فنوتیپی این گیاه دارویی دارد. غلظت ۰۱/۰% EMS بهترین نتیجه معنی‌دار را در سطح ۱% و از کشت ریزنمونه‌های که شامل جوانه‌های جانبی و انتهایی بوده‌اند به‌دست آورده که برروی خصوصیاتی همچون طول ساقه، تعداد برگ و تعداد جوانه جانبی اثر داشت. آنالیز اسانس تیمارها نیز انجام شد که نتیجه آن بی‌اثر بودن این ماده اتیل متان سولفانات روی مواد اجراء اسانس این گیاه بوده است.
کلمات کلیدی: اتیل متیل سولفانات (EMS)، اجزاء اسانس، کشت درون شیشه‌ای، محیط کشت MS، نعناع فلفلی (Mentha piperita).
۱-۱ مقدمه:
گیاهان به عنوان یکی از اجزاء طبیعت، از دیرگاه پشتوانه غنی نیازهای بشری بوده‌اند و می‌توان با اطمینان گفت تا زمانی که انسان در این کره خاکی به سر می‌برد، به گیاهان نیاز دارد (سلیمان زاده، ۱۳۷۷).
در بحث گیاهان دارویی، محدودیت‌های کاشت و نگهداری آن‌ها متعدد می‌باشد که از آن جمله می‌توان به کوتاه بودن فصل کاشت و یا برداشت بعضی از گونه‌های گیاهی، کمبود زمین‌های مناسب جهت داشت، ناچیز بودن مواد موثره حاصل از گیاه و غیره اشاره کرد (ثقه الاسلام و موسوی، ۱۳۸۵).
یکی از راه‌های رفع این محدودیت‌ها کشت بافت گیاهی[۱] است. تکنیک‌های کشت بافت گیاهی درحال حاضر به عنوان یک ابزار قوی جهت رفع مشکلات اساسی و کاربردی بیولوژی گیاهی درآمده است.
استفاده از گیاهان به عنوان دارو از زمان‌های خیلی دور در معالجه انسان و دام مرسوم بوده است. در حال حاضر حدود یک سوم داروهای مورد استفاده دارای منشاء گیاهی می‌باشند. کشورهای آسیایی بخصوص هند، چین و ایران سابقه بسیار طولانی در این زمینه دارند. این گیاهان مواد زیستی بخصوص و فعال با مقادیر بسیار کم تولید می‌کنند که تحت عنوان متابولیت‌های ثانویه نام‌گذاری می‌شوند. در عصر جدید، دانشمندان علوم گیاهی با بهره گرفتن از آخرین تکنیک‌های عملی کشت بافت گیاهی، توانسته‌اند از انواع گیاهان ترکیب‌های بسیار مفیدی را جهت مداوای بیماری‌های سخت و غیر قابل مداوا و موارد استفاده دیگر، بدست آورند. در طی چند دهه اخیر روش‎های متفاوتی با بهره گرفتن از بیوتکنولوژی[۲] درزمینه پرورش محصولات گیاهی برتر ابداع شده است که از جمله آن‌ها می‌توان روش‌های ایجاد گونه‌های جهش یافته[۳] و پلی پلوئید[۴] را نام برد.
گیاهان دارویی فراوانی در کشور ما می‌رویند که بسیاری از آن‌ها از جمله نعناع فلفلی دارای طیف وسیعی از خواص دارویی می‌باشند. برهمین اساس بررسی و مطالعه گیاهان دارویی ایران با بهره گرفتن از ابزارهای امروزی ضروری به نظر می‌رسد. کشت سلول و بافت که به عنوان کشت درون شیشه‌ای[۵] و یا کشت استریل نیز مطرح می‌شود، ابزاری مهم در مطالعات پایه و کاربردی بوده و دارای کاربردهای تجاری است (رجب‌بیگی و همکاران، ۱۳۸۵؛ سونانداکوماری و همکاران[۶]، ۲۰۰۳). یکی از این کاربردها امکان ایجاد گیاهان ترانسژنیک با وارد کردن DNA تقریبا از هر منبع دیگری می‌باشد. شاید اولین قدم در زمینه کشت بافت گیاهی در سال ۱۷۵۶ توسط هنری لوئیس داهامل برداشته شد، زمانی که وی شاهد تشکیل کالوس[۷] در حین مطالعه مواد التیام دهنده زخم‌های گیاهی بود (غضنفری[۸]، ۱۹۹۴).
اساس تئوری کشت بافت گیاهی توسط گتلیت هابرلنت از آکادمی علوم آلمان در سال ۱۹۰۲، بعد از آزمایش‌های وی روی کشت تک سلول‌ها پیشنهاد گردید (هابرلنت[۹]، ۱۹۰۲). توسعه روش‌های کشت بافت و زیست‌شناسی مولکولی برای تبادل DNA بین موجودات زنده غیر خویشاوند این امکان را می‌دهد که ژن‌های جدیدی از موجودات زنده خارج از سلسله گیاهی به درون گیاهان گیرنده وارد شوند. لذا مطالعه حاضر می‌تواند کمکی جهت بررسی و واکنش‌های گیاه نعناع فلفلی نسبت به تکنیک‌های مختلف کشت بافت و باززائی این گیاه از طریق کشت بافت و اثر مواد جهش‌زائی همچون اتیل متان سولفانات[۱۰] (EMS) باشد، تا محققین دیگر بتوانند به مطالعه خواص دارویی یا تغییرات لازم در مواد موثره یا فعال (متابولیت‌های ثانویه) و یا مطالعات انتقال ژن در این گیاه بپردازند.
۱-۱-۱ اهمیت موضوع
برای انجام کشت بافت نعناع فلفلی (Mentha piperita) از بخش‌های مختلف گیاه مانند ریشه، برگ، ساقه و گره استفاده شد (سونانداکوماری و همکاران، ۲۰۰۳؛ ساجانا و همکاران[۱۱]، ۲۰۱۱). با توجه به اینکه روش معمول اصلاح و بهبود تولید متابولیت‌های ثانویه در گیاهان دارویی شامل کاشت آن‌ها در مزرعه و سپس برداشت و استخراج این مواد به روش‌های شیمیایی و غیره با مشکلات متعددی نظیر شرایط محیطی و زراعی، صرف زمان، هزینه و استفاده نیروی کار زیاد و همچنین خطرنابودی برخی از گیاهان دارویی کمیاب روبرو است، استفاده از روش‌های نوین از جمله کشت درون شیشه‌ای (in vitro) ضرورت می‌یابد به همین منظور اولین بار در سال ۱۹۷۶ توسط زنیک تکنیک کشت سوسپانسیون سلول‌های گیاهی حاوی متابولیت‌های ثانویه انجام گرفت. البته در ارتقاء بیوسنتز متابولیت‌های دارویی در شرایط درون شیشه‌ای اغلب، گیاهانی انتخاب می‌شوند که بازده تولید متابولیت‌های با ارزش در آن‌ها بالا باشد (باقری و صفاری، ۱۳۸۷).
نعناع فلفلی به عنوان یک گیاه دارویی شناخته می‌شود (امیدبیگی، ۱۳۸۴،۱۳۸۹). تاکنون مطالعات زیادی در مورد تعیین مواد موثره نعناع فلفلی صورت گرفته است (کاظم الوندی و شریفان، ۱۳۸۸). موارد مصرف و خواص دارویی آن نیز به خوبی مطالعه شده است اما مطالعات کشت بافت و ایجاد جهش زیاد نبوده است. با توجه به اینکه تکثیر این گیاه از طریق بذر مشکل است (بدلیل بذور کم و نابارور)، بهترین و سریع‌ترین راه برای داشتن گیاه جهت مصارف صنعتی، کشت بافت است. همچنین با در نظر گرفتن اهمیت و خواص دارویی این گیاه، مطالعات کشت بافت و بهینه‌سازی محیط کشت جهت اهداف مختلف برای این گیاه ضرورت دارد.
۱-۱-۲ فرضیات
۱- کشت بافت یکی از راه‌های سریع در ازدیاد انبوه نعناع فلفلی می‌باشد.
۲- نعناع فلفلی در محیط کشت همواره در دسترس برای اعمال هر گونه اعمال تیمار از قبیل جهش می‌باشد.
۳- ایجاد جهش نقطه­ای تا چه میزانی می‌تواند بر روی مواد موثره و میزان اسانس تغییر ایجاد نماید.
۱-۱-۳ اهداف پژوهش
۱- آشنایی با تکنیک کشت بافت گیاه دارویی نعناع فلفلی و تکثیر آن در داخل شیشه.
۲- بدست آوردن مقدار قابل توجه گیاه در حال رشد برای اعمال جهش نقطه‌ای در نعناع فلفلی.
۳- بررسی تغییر در میزان مواد موثره گیاه در غلظت‌های مختلف ماده جهش‌زای EMS
۱-۲ کلیات
۱-۲-۱ گیاه شناسی
نعناع فلفلی با نام علمی Mentha piperita L. و بـا نـام عمومی Peppermint ازخانواده نعناعیان یک گیاه علفی چند ساله است که در رده‌بندی گیاهی از تیرهLamiaceae راسته Lamialse و رده Rosidae می‌باشد (فوستر[۱۲]، ۱۹۹۶؛ پیرس[۱۳]، ۱۹۹۹). برگ‌های آن بیضوی ، متقابل ، نوک تیز ، دندانه‌دار کمی پوشیده از کرک به درازای ۷-۴ سانتی‌متر و به عرض ۳-۲ سانتی‌متر است (فلمینگ[۱۴]، ۱۹۹۸). گل‌ها کامل نامنظم، اکثراً دوجنس یا هرمافرودیت و مجتمع به صورت گروهی در روی ساقه و در انتهای ساقه ظاهر می‌شوند گل‌ها در ماه‌های مرداد و شهریور ظاهر می‌شوند (امیدبیگی، ۱۳۸۴،۱۳۸۹). رنگ آنها گلی روشن یا کم و بیش ارغوانی مایل به بنفش می‌باشد و به تعداد زیاد نیز در مجاورت یکدیگر به نحوی مجتمع می‌شوند که مجموعاً در قسمت انتهای ساقه‌ها ، به صورت سنبله‌هایی با شکل ظاهری، بیضوی و نوک تیز جلوه می‌کند (شکل۱-۱). برخی از شاخه‌های این گیاه عقیم و عاری از گل باقی می‌ماند. عمر گل‌ها بسیار کوتاه و مدت کمی پس از تشکیل از گیاه جدا می‌شود، میوه کپسول ، کوچک و به رنگ قرمز تیره است (امیدبیگی، ۱۳۸۴،۱۳۸۹).
تعداد صفحه :۸۹
قیمت : ۱۴۷۰۰ تومان

***

—-

پشتیبانی سایت :        ****       [email protected]